S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3在膝骨关节炎中的表达及意义

刘晓，宋晓飞，郑小刚

（1.南阳市内乡县人民医院 骨科，河南 南阳 474300；2.南阳市中心医院 骨二科，河南 南阳 473000）

骨性关节炎作为临床常见骨科疾病，以关节软骨变性、半月板及韧带退变等为主要表现，属于慢性进行性骨关节疾病，对患者日常活动及生活质量产生极大的消极影响［1-2］。目前，现代医学尚未完全阐明其具体病理机制，且临床主要依赖与临床体征变化、影像学表现评估病情严重程度，缺乏客观指标，致使临床预防及治疗难度增加［3］。研究发现，活性因子在关节炎病理进展中发挥重要作用［4］。S100 钙结合蛋白B（S100 calciumbinding protein B,S100B）作为S100 钙结合蛋白家族成员，参与影响细胞增殖、分化等生物学过程；软骨破坏作为骨性关节炎主要病理改变，或与膝骨关节炎的发生相关；Ⅱ型胶原羧基端端肽（Ctelopeptide of type Ⅱcollagen,CTX-Ⅱ）作为关节软骨主要成分Ⅱ型胶原蛋白降解产物，其数值变化与骨性关节炎相关［5-6］；而NOD 样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3,NLRP3）作为多蛋白复合物，激活后可通过活化caspase-1 对白介素细胞等细胞因子生成、分泌产生诱导，调节机体炎性反应［7］。但临床中对S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3在膝骨关节炎中的表达情况尚不清晰，基于此，以上述内容为背景，测定血清中S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 表达水平，分析其在膝骨关节炎中的表达及意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2020 年9 月至2021 年9 月南阳市内乡县人民医院收治的79 例膝骨关节炎患者为研究组，其中男49例，女30 例；年龄45～61岁，平均（53.00±6.80）岁；按照Recht 标准［8］分为Ⅰ级25 例、Ⅱ级33 例、Ⅲ级21例。另选100 例同期体检健康人员为对照组，其中男58例，女42例；年龄42～69 岁（55.50±11.48）岁。两组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经院伦理委员会批准。

纳入标准：符合《骨关节炎诊治指南（2007年版）》中对膝骨关节炎的相关诊断标准［9］；年龄40～70 岁；存在关节活动受限、关节疼痛等表现；X 线检查显示关节缘见骨赘、关节间隙变窄；对照组人员无任何相关疾病；签署知情同意书。

排除标准：肝肾功能不全；存在糖尿病、高血压等其他内分泌疾病史；免疫功能障碍；并发类风湿关节炎、代谢性关节病；恶性肿瘤；合并流感、感染性肺炎等其他感染性疾病；2 周内服用影响软骨代谢药物；近期内存在抗风湿或免疫抑制剂治疗史；近期内下肢损伤或手术者；长期服用补钙药物。

1.2 指标观察

1.2.1 S100B、CTX-Ⅱ水平测定 采集两组受检者体检当日空腹外周静脉血5 mL，常温静置，高速离心（转速：3 000 r/min，半径：12 cm）10 min，分离上清，采用双抗体夹心ELISA 法测定S100B、CTX-Ⅱ水平，设置酶标板为空白孔、标准孔、待测样品孔，每孔加入50 μL 稀释液，后依次加入样品稀释液、标准品、待测样片各50 μL，混匀，覆膜，室温孵育2 h。弃孔内液体，甩干，清洗反应板。加入S100B、CTX-Ⅱ检测液100 μL/孔，覆膜，常温孵育60 min，弃孔内液体，甩干、洗涤反应板，加入100 μL/孔底物溶液，遮光显色0.5 h，加入终止液，轻弹酶标板终止反应。酶标仪（型号iMark，Bio-RAD 公司）450 nm 处测定吸光值，由高资历检验医生严格遵循试剂说明书进行操作。

1.2.2 NLRP3 表达水平测定 采用RT-PCR 法测定，microRNA 提取分离试剂盒分离血清总RNA，测定所得RNA 纯度、完整度。采用TaqMan microRNA 反转录试剂盒进行microRNA 逆转录，采用SYBR Premix ExTaq II kit 进行定量PCR 反应，设置反应条件：预火95℃，预变性30 min，取出降温至90℃，变性5 s，迅速降温至58℃，退火20 s，温度保持60℃，延伸45 s，连续循环40次，重复实验3次。以β-actin 为内参，采用2-△△Ct方法计算NLRP3 相对表达量。β-actin：上游引物：5'-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3'；下游引物：5'-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3'，NLRP3：上游引物：5'-CCCCGTGAGTCCCATTA-3'；下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

1.3 统计学方法

使用 SPSS 20.0 软件分析数据。应用Kolmogorov-Smirnov 检验数据是否符合正态分布，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间行样本F检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 表达水平比较

相比对照组，研究组S100B、CTX-Ⅱ水平升高，NLRP3 表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 表达水平比较（）

表1 两组S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 表达水平比较（）

2.2 不同Recht 等级患者S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 表达水平比较

与I 级、II 级患者比较，III 级患者S100B、CTX-Ⅱ水平较高，NLRP3 表达水平较低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同Recht 等级患者S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3表达水平比较（）

表2 不同Recht 等级患者S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3表达水平比较（）

2.3 S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 与膝骨关节炎严重程度相关性分析

以S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 进行相关性分析，结果显示S100B、CTX-Ⅱ与膝骨关节炎严重程度呈正相关；NLRP3 与膝骨关节炎严重程度呈负相关。见表3。

表3 S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 与膝骨关节炎严重程度相关性分析

2.4 S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 的相关性

膝骨关节炎患者S100B、CTX-Ⅱ呈现正相关（r=0.613,P=0.015）；S100B、NLRP3 呈现负相关（r=-0.821,P=0.005）；CTX-Ⅱ、NLRP3 呈现负相关（r=-0.765,P=0.007）。见图1。

图1 S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 的相关性

2.5 ROC 曲线图分析S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3对膝骨关节炎的诊断价值

ROC 曲线分析显示，与S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 单项诊断相比，三项联合对膝骨关节炎的诊断价值较高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4、图2。

图2 ROC 曲线图分析S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 对膝骨关节炎的诊断价值

表4 ROC 曲线图分析S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 对膝骨关节炎的诊断价值

3 讨论

临床医学中将关节周围软骨受力学、生物学等因素所致的退变统称为骨性关节炎，为老年人多发疾病，以关节软骨损害为主要特征，畸形、持续性疼痛、关节功能障碍为主要症状，对患者身心健康造成极大影响［10］。但有学者指出，力学、生物学等因素虽可影响膝骨关节炎发生及进展，但任何单一因素均无法诱发膝骨关节炎，提示膝骨关节炎的发生或是多因素共同作用所致。故及早且有效评估膝骨关节炎病情对预防及临床方案制定具有独特意义［11］。

研究指出，S100 家族分子与滑膜炎、骨性关节炎的发生及进展存在关联，但临床医学尚未明确S100B 在骨性关节炎中的作用机制［12］。研究指出，S100B 在软骨损伤软骨细胞凋亡及滑膜组织炎症中发挥独特作用，提示S100B 可通过干预细胞增殖、分化等生物学过程，影响生物机械力学信号传递；另外S100B 可通过持续激活RAGE 破坏细胞内氧化还原反应，参与细胞炎性反应［13-14］。相关学者指出，膝骨关节炎患者S100B 表达水平高于健康人员，且S100B 表达与Recht 标准分级存在相关联系，提示S100B 在膝骨关节炎发病机制中的可能作用［15］。本研究发现，膝骨关节炎患者S100B 水平显著高于健康人员，且S100B 水平随疾病严重程度分级升高而增加，证实S100B 参与膝骨关节炎发生及病理进展过程。分析其原因或为S100B 作为炎性机制参与膝骨关节炎发生，而高表达S100B 可通过增加机体炎症损伤从而诱发软骨病理损伤。

研究指出，由胶原、聚糖等固相成分组成的软骨在维持膝关节结构完整过程中发挥重要作用，而膝关节结构完整性的破坏是膝骨关节炎病变的主要病变表现［16］。作为膝关节软骨胶原中主要成分，CTX-Ⅱ可对胶原纤维代谢情况反映，从而反映软骨病理变化［17］。研究发现，膝骨性关节炎患者CTX-Ⅱ水平异常升高，且其含量变化与半月板、软骨组织损伤程度存在一定关联；另外CTX-Ⅱ在软骨损伤早期便呈现异常升高，且其升高趋势随软骨损害程度增加而增加，推测其在膝骨关节炎发病机制中的可能作用［18-19］。本研究发现，膝骨关节炎患者血清中膝骨关节炎呈现出异常上升的趋势，且随骨损害程度增加而升高。结合上述研究猜想CTX-Ⅱ与膝骨关节炎发生及进展存在关联，出现这种情况的原因或为CTX-Ⅱ受疾病迁延、软骨损伤加重而被大量分泌进入循环系统，后经肾脏排出，致使血液内CTX-Ⅱ表达量增加。

炎性因子在膝骨关节炎发生及发展中发挥重要作用。NLRP3 炎性小体作为固有免疫组分可对机体炎症反应作出调节［20］。研究发现，关节间隙脂多糖、三磷酸腺苷增加可通过NLRP3 促进膝骨关节炎发生，提示NLRP3 在膝骨关节炎中的异常与炎症反应相关；另外由于NLRP3 在类风湿性关节炎及活动性类风湿关节炎患者外周血细胞中表达水平显著低于健康者，推测NLRP3 在膝骨关节炎发病机制中的可能作用［21-22］。本研究发现，膝骨关节炎患者NLRP3 表达水平显著低于健康者，且其水平变化随疾病加重而降低，证实低表达NLRP3 与膝骨关节炎发生及病理进展相关。分析其原因或为低表达NLRP3 在膝骨关节炎中对炎症应激过程发挥保护作用相关。

综上所述，膝骨关节炎的发生及病理进展或与血清中S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 异常表达相关，可作为评估膝骨关节炎严重程度的潜在生物学指标。