急性肺损伤鼠类模型的研究进展

姚安洁， 饶晗钰， 王冰冰， 王昌惠， 谢栓栓

(1. 同济大学附属第十人民医院呼吸与危重症医学科，上海 200072； 2. 同济大学医学院，上海 200092)

急性呼吸窘迫综合征是导致急性呼吸衰竭的重要原因之一，特点是顽固性低氧血症和进行性呼吸窘迫，其主要临床表现包括急性或进展性呼吸困难，以及胸部X线和CT显示双肺浸润[1]。在全球，急性呼吸窘迫综合征患者约占重症监护病房入院人数的10%，每年约有超过300万名患者，重症者死亡率甚至高达46%[2-3]。因此，迫切需要建立合适的急性肺损伤动物模型来研究其发病机制。而小鼠和大鼠因其因易操作，繁殖快，相关性好等优点，成为研究急性肺损伤最常用的实验动物[4]。本综述主要是阐述急性肺损伤不同鼠类模型的优缺点，并就未来研究中如何完善动物模型提出建议。

1 急性肺损伤动物种类的选择

急性呼吸窘迫综合征的发病机制很复杂，各种致病因子和炎症介质通过损伤肺泡上皮和毛细血管内皮细胞引起肺水肿和透明膜形成，从而使肺泡通气血流比例失调，导致Ⅰ型甚至Ⅱ型呼吸衰竭[5]。鼠类的呼吸道结构不仅与人类有许多相关之处，能更好的模拟急性肺损伤的病理生理变化，而且容易敲除基因，能更有针对性地研究急性呼吸窘迫综合征的发病机制[6]。免疫缺陷鼠需要在无特定病原级条件下饲养，实验方法多样，常见的包括CD-1小鼠、C57BL/6小鼠、Balb/c小鼠、C3H/HeN小鼠、DBA/2J小鼠和Sprague-Dawley大鼠等。其中小鼠中最常用的是C57BL/6小鼠和Balb/c小鼠，大鼠中最常用的是Sprague-Dawley大鼠，以下主要介绍这3种最常用的转基因鼠类模型。

1.1 C57BL/6小鼠

此类小鼠于1921年由Lathrop小鼠近交培育得到的C57BL小鼠的第六组系，特点是品系稳定且易于繁殖，也是第一个完成基因组测序的小鼠品系，故常用于构建遗传背景较为稳定的转基因动物模型。该鼠乳腺癌发病率较低，有眼睛缺损，对放射性有抵抗力，对结核杆菌敏感，对鼠痘病毒有一定的抵抗力，干扰素产量高，对百日咳易感因子敏感。在研究急性肺损伤的发病机制时，因其能较好地展现肺损伤时机体炎症反应的变化，常用于构建内毒素肺损伤模型，高氧暴露肺损伤模型，博来霉素肺损伤模型，病原体肺损伤模型，缺血再灌注肺损伤模型，盲肠结扎或穿刺肺损伤模型以及其他二次打击肺损伤模型等。

1.2 Balb/c小鼠

此类小鼠于1932年由白化小鼠近交得到。特点是乳腺肿瘤自然发生率低，但用乳腺肿瘤病毒诱发时发病率高;卵巢、肾上腺和肺的肿瘤也有一定的发生率。易发生呼吸系统疾病相关的感染，对放射线敏感，有自发性高血压和动脉硬化症，对脂多糖较敏感，广泛用于免疫学、肿瘤学等病理生理的研究。在研究急性肺损伤的发病机制时，因其也能较好地展现炎症反应的变化过程，故也常用于构建所有适合C57BL/6小鼠的肺损伤模型，但不如C57BL/6小鼠常用。

1.3 Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)

此类大鼠于1925年由Wistar大鼠近亲培育而成，但发育更快，且自发性肿瘤的发生率较低。该鼠对性激素敏感，对呼吸道疾病有较强的抵抗力，故常用于营养学，内分泌学和毒理学研究。在研究急性肺损伤的发病机制时，因其能更直观清楚地展现肺通气功能的变化，故常用于构建一些同样适用于兔，犬，猪，羊等大型实验动物的肺损伤模型，比如油酸吸入肺损伤模型，盐水灌洗肺损伤模型，机械通气肺损伤模型等。

2 急性肺损伤动物模型的特点

啮齿类动物是应用最广泛的急性肺损伤动物模型，但是由于不同物种间的先天性差异，造成了模拟急性肺损伤过程中的差异，所以在从动物实验转向临床研究应用时要充分考虑这些差异。

2.1 Toll样受体的物种差异

人类的白细胞通过Toll样受体(toll-likere-ceptors， TLR)来识别微生物尤其是脂多糖，而小鼠的Toll样受体4(TLR4)识别的是与人类不同的脂多糖结构。人类与小鼠的TLR4中酰基链的空间结构以及饱和度都不同，故引起的炎症反应也不同[7]。因此，在设计急性肺损伤动物模型时应考虑此物种差异。

2.2 单核吞噬细胞系统的物种差异

单核巨噬细胞系统(mononuclear phagocyte system， MPS)由巨噬细胞及其前体细胞组成，人类的肺毛细血管内皮细胞上附有肺血管内巨噬细胞(pulmonary intravascular macrophages， PIM)，能与微生物及其产物结合并局限在肺中。而小鼠和大鼠缺少PIM，其血管内的巨噬细胞及其结合的微生物主要局限在肝和脾中[8]。因此，动物对于肺损伤的反应不如人类敏感。

2.3 一氧化氮的物种差异

研究表明，一氧化氮(nitric oxide， NO)参与肺损伤的发病机制。人类的巨噬细胞非激活状态下产生的NO很少，而大鼠和小鼠的肺泡巨噬细胞能产生大量的NO，这是由于两者可诱导的NO激酶的作用与活性NO的含量不同[9]。

2.4 趋化因子和趋化因子受体的物种差异

人类免疫系统中的白细胞介素-8(interleukin 8， IL-8)，在急性肺损伤的过程中能招募中性粒细胞到特定部位。大鼠和小鼠无IL-8，但可以产生IL-9和IL-10，吸引浆细胞样树突细胞至肺，在增强中性粒细胞的防御功能中起到了关键的作用[10]。

由于以上物种差异的存在，因此必须非常重视从动物实验到人体试验的转化过程，比如动物模型所证实的发现应该在一种以上的大型哺乳动物中也得到证实才能外推到人体试验，还应特别关注并比较不同物种试验过程中能反映肺泡毛细血管通透性和炎症反应变化的具体测量数值，而且进行人体试验时的剂量和措施也应该更加谨慎等。

3 急性肺损伤动物模型的构建

急性肺损伤的动物模型是基于与人类呼吸窘迫综合征相关的一些临床疾病构建的，比如细菌感染、缺血再灌注损伤、创伤、腹膜炎等疾病，其中高潮气量或高峰值吸气压力的机械通气、肺部或全身内毒素给药以及盲肠结扎后穿刺法都是最常用的动物肺损伤模型。此外联合不同的模型还可以构建二次打击模型，如使用盐水灌洗或脂多糖气管内滴注后继以机械通气、盲肠结扎穿刺继以出血，或腹膜炎继以肠道缺血再灌注损伤，气管内先后滴注盐酸和内毒素等[11]。以下将从组织学分类，介绍基于肺毛细血管内皮细胞损伤、肺泡上皮损伤或两种损伤均有的各种肺损伤模型，见表1。

表1 不同急性肺损伤模型的对比

3.1 以肺毛细血管内皮细胞损伤为主的模型

3.1.1 内毒素 内毒素，又叫脂多糖(lipppolysa-ccharide， LPS)，是存在于革兰阴性菌外膜中的糖脂，能与血清中特定的LPS结合蛋白结合并激活单核细胞、巨噬细胞等其他细胞上的TLR4受体，进而介导炎症反应。

脂多糖模型有气管滴注法和静脉注射法。Yang等[12]以成年雄性C57BL/6小鼠为实验对象，通过气管内滴注溶解在50 μL无菌盐水中的LPS(5 mg/kg，来自大肠杆菌O111： B4)来构建急性肺损伤模型。LPS滴注后每6 h计算一次存活率；LPS注射后12 h处死小鼠，将致死剂量的LPS(25 mg/kg)注射到气管中用于生存研究。Gong等[13]将10周龄雄性BALB/c小鼠气管插管后，滴注LPS(3 mg/kg，来自大肠杆菌血清型O55： B5)。也有将脂多糖模型应用到大鼠模型中的实验。Wu等[14]以雄性Sprague-Dawley大鼠为实验对象，尾静脉注射0.5 mg/kg LPS生理盐水，注射体积为0.2 mL(LPS： 1 mg/mL)。

脂多糖模型可重复性好，易于操作，更有利于研究细菌感染引起的炎症反应；但是容易被污染，且引起的内皮损伤可能不明显。

3.1.2 油酸 油酸(oleic acid， OA)模型可以模拟由脂质栓塞引起的急性呼吸窘迫综合征，脂肪酸直接作用于肺毛细血管内皮细胞并触发免疫系统的激活，最终导致细胞损伤。

动物模型通常为大鼠，通过注射盐形式的油酸来避免血液乳化的不良影响。Tian等[15]将雄性Sprague-Dawley大鼠静脉注射OA的盐溶液(1 mL盐水中加入0.4 mmol/kg的OA)，对照组则注射1 mL/kg 的生理盐水。注射OA后30 min内就会迅速造成内皮细胞损伤，进而导致肺部斑片状炎症，肺泡渗透性增加和气体交换障碍[16]。

油酸模型的优点是具有可重复性和快速起效性，但是可能不适合研究脓毒症所致的急性呼吸窘迫综合征，也不适合研究通过改变炎症反应以降低肺损伤程度的治疗方案。

3.2 以肺泡上皮细胞损伤为主的模型

3.2.1 吸入酸 胃内容物吸入后可能会导致吸入性肺炎，严重者进展至急性呼吸窘迫综合征，因此研究中常用盐酸(hydrochloric acid， HCl)来模拟胃酸吸入引起的肺损伤。

Kral-Pointner等[17]以C57BL/6J小鼠为研究对象，麻醉之后用盐酸(50 μL，浓度为0.1 mol/L)行气管内滴注以诱导急性肺损伤，之后用磷酸盐缓冲液灌洗得到支气管肺泡灌洗液，待动物死亡后取肺组织进行下一步研究。

吸入性肺炎能导致远处器官的中性粒细胞依赖性损伤，因此有利于研究急性呼吸窘迫综合征中性粒细胞炎症反应机制。但是要区别的是，有害酸和无害酸浓度之间的差异非常小，而且人类不吸入单纯的HCl，而是吸入由颗粒物质、细菌产物、细胞因子和胃酸等复杂成分构成的胃内容物。

3.2.2 高氧 人类暴露在高浓度氧气中长达3 d也不会导致肺损伤，但是大多数哺乳动物暴露于高氧中会导致呼吸窘迫和死亡，是因为高氧可能通过活性氧或者与NO相互作用来加重急性肺损伤的程度。

为了构建高氧造成的急性肺损伤模型，Guo等[18]将C57BL/6J小鼠在出生后第1天到第7天或第1天到第14天连续暴露于室内空气(21%O2)或高浓度氧气室(85%O2)中，而且要在常氧和高氧条件之间切换24 h以避免氧中毒。

高氧模型可导致明显的肺部渗出变化，但是与人类疾病的相关性尚不明确，而且需要专门的设备和知识来保证输送足够浓度的氧气，故不常用。

3.2.3 盐水灌洗 当用生理盐水反复灌洗肺后，肺泡表面活性物质会迅速耗竭导致肺泡壁塌陷，之后再进行大容量机械通气且无正压通气时，就会造成一种类似于人类急性呼吸窘迫综合征的肺损伤。盐水灌洗模型通常用于兔子，猪等大型实验动物中，但也见于大鼠中，且后续通常需要增加如内毒素滴注或机械通气等二次损伤操作。

Kuethe等[19]将雄性Sprague-Dawley大鼠用10 mL/kg的生理盐水进行2次盐水灌洗，然后用注射器回收肺部的液体和泡沫，1 h后可得到明显的肺部渗出的影像结果。

盐水灌洗模型提供了一种理想的方法来研究不同机械通气策略对急性肺损伤发展的影响，但是实验操作复杂，而且不适合模拟急性呼吸窘迫综合征的初始病理生理机制。

3.2.4 机械通气 机械通气可以直接导致肺损伤，也可以出现在急性呼吸窘迫综合征的治疗过程中，因此可以模拟出对患者生存影响最大的临床情况。机械通气模型的实验对象通常是大鼠或者更大型的实验动物，如兔、猪、羊等。

Katira等[20]以成年雄性S-D大鼠为实验对象，先构建脓毒血症模型，然后建立静脉通路、气管切开和颈动脉插管并维持麻醉，设置好标准后(潮气量： 6 mL/kg；呼吸频率： 60/min；氧浓度： 21%；呼气末正压： 3 cmH2O)进行通气并记录参数。稳定后，将动物随机分配成为以下组别，即气道压力分别为14、30、45 cmH2O，机械通气1 h直至死亡。

机械通气模型的优点是具有相当大的临床意义，缺点是操作复杂，而且动物与人类的机械通气时间也是不同的，有待在未来进一步研究。

3.2.5 博来霉素 博来霉素是一种从放线菌和链霉菌中分离出来的毒素，主要导致肺纤维化，通常用于研究急性肺损伤早期纤维化愈合的过程。博来霉素通常采用气管滴注法。

Cui等[21]以雄性C57BL/6小鼠为研究对象，麻醉后在颈部气管行垂直，再使用胰岛素注射器，将250 μL硫酸博来霉素的盐溶液(0.5 U/kg或1 U/kg)注入气管，手术闭合切口，构建博来霉素动物模型。

博来霉素模型易操作，可重复性好，但是不易形成透明膜，刺激性过强故与临床的关系可能缺乏确切的依据。

3.3 肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮损伤均有的模型

3.3.1 病原体 病原体法是将不同的细菌，真菌或者病毒通过鼻内或者气管滴注给动物，从而构建不同的急性肺损伤模型。常用的病原体包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、白念珠菌，呼吸道相关病毒等。其中铜绿假单胞菌是导致重症监护病房里呼吸机相关性肺炎的主要病原体[22]，大肠杆菌是导致脓毒血症的重要病原体[23]。

Faure等[24]以C57BL/6小鼠为研究对象，鼻内滴注50 μL含铜绿假单胞菌的细菌溶液(1×107CFU，2×107CFU或1×108CFU菌株)，24 h后处死小鼠；Li等[25]以Balb/c小鼠为研究对象，气管内注射100 μL含白念珠菌的细菌溶液(1×107CFU菌株)，治疗后48 h吸入CO安乐死；Leist等[26]用以上两种小鼠为研究对象，先通过连续传代得到一种含有重组小鼠易感染的新冠病毒SARS-CoV-2 MA10的细胞，再通过鼻内滴注105CFU此细胞和不同剂量的稀释在缓冲液中的此细胞来感染小鼠，最终经过实验发现C57BL/6小鼠的感染症状比Balb/c小鼠轻[26]。

此类模型易操作，但要根据每种病原体的不同特点和研究的目的方向来选择合适的动物模型。

3.3.2 烟雾损伤 长期吸烟是造成慢性阻塞性肺病的重要诱因，但香烟等有害烟雾也可能造成急性肺损伤。

比如，Dong等[27]以Balb/c小鼠为研究对象，将其暴露在有一定浓度的特定香烟烟雾的通风室，每天连续3次，每次2 h用完3支特定香烟每周5 d，连续2周，以构建香烟烟雾引起的急性肺损伤动物模型。

此类模型有助于研究慢性阻塞性肺疾病中发生急性肺损伤的病理生理机制，进而更好地研究此类疾病整体的发病机制。

3.3.3 缺血再灌注损伤 在肺部或远处血管中缺血后再灌注(ischemia/reperfusion， I/R)可导致肺损伤，通常见于肺移植后的肺损伤。大鼠常用于构建除肺部以外的远处器官血管的缺血再灌注损伤模型。

此类模型可以研究人类外周器官缺血再灌注后肺损伤的发病机制，但是此过程中肺部损伤往往是轻微的，需要继发性刺激(如LPS)才能引起显著的肺损伤，故通常会构建二次打击模型。

3.3.4 脓毒血症 临床上，许多患者在腹膜炎发生后继发脓毒血症，进而导致急性呼吸窘迫综合征。诱导脓毒血症的实验方法主要有活细菌法、盲肠结扎和穿刺法(cecum ligation and puncture， CLP)，以及内毒素法。与活细菌法和脂多糖法相比，盲肠结扎和穿刺法见效快，持续时间长，且进行性发作，因而是更常用的急性肺损伤动物模型。

Chen[29]以雄性C57BL/6小鼠为实验对象，麻醉小鼠后腹部切开暴露盲肠，剥离肠系膜后在盲肠末端用4号线结扎盲肠。接着用21号无菌针在结扎远端1 cm处进行盲肠穿刺，最后进行伤口缝合。使用1 mL预热的生理盐水(37 ℃)用于小鼠液体复苏，每6 h皮下注射1次丁丙诺啡用于镇痛。

CLP可能是研究脓毒症和器官损伤的单一最佳动物模型，但是肺内炎症和透明膜形成不太明显，而且手术复杂，而且实际菌群未知，造成的影响也未知。

4 急性肺损伤动物模型的评价方法

不论是在临床中的人类急性呼吸窘迫综合征，还是在动物实验模拟的急性肺损伤，都有以下4个方面的特征表现： 组织学损伤，肺泡毛细血管屏障损伤，炎症反应和生理功能障碍。动物实验需要至少3个方面发生改变才能证明急性肺损伤模型已经成功构建，而随着动物实验转化为临床前药物试验甚至至临床实践研究，则至少需要4个方面均发生改变，并且每个方面至少要有1种测量方法来评价变化。

4.1 组织损伤评价

组织学变化是急性肺损伤最相关的特征，主要包括： 肺泡腔充满肺泡液和细胞碎片，肺泡上皮细胞损伤，中性粒细胞浸润，肺泡间隔增厚以及透明膜出现。

通常在动物死亡后将肺组织切片进行苏木精-伊红染色，然后在显微镜下观察病理组织变化，此方法操作简便。虽然某些急性肺损伤模型可能需要特定的组织学评价标准[30-31]，但是仍然需要一个相对统一和可靠的组织学评分标准以及计算机系统，以广泛应用于急性肺损伤研究中。

4.2 屏障损伤评价

肺泡-毛细血管屏障破坏是急性肺损伤的重要特征，会导致富含蛋白质的液体充满肺泡腔，故支气管肺泡灌洗液中白蛋白等其他循环蛋白的含量增高，肺湿干比增加，肺血管通透系数增加。主要分为肺泡-毛细血管通透性增加的测量，和血管外肺水增加的测量。评价肺泡-毛细血管屏障的损伤程度，通常的方法是用伊万斯蓝染料作示踪剂，它可以与白蛋白紧密结合，从而反映渗入肺泡腔中的蛋白液的含量。测定血管外肺水含量最准确的方法是重量法，测量死亡后的肺组织重量即湿重，烘干后再测量即干重，两者相比为干湿比。目前还探索了其他方法，比如热稀释技术[32]，电阻抗断层扫描技术等[33]，不如重量法准确但是无创，有望改进后在未来应用于临床。

4.3 炎症反应评价

炎症反应是急性肺损伤过程中另一项重要的特征，主要包括： 趋化因子或细胞因子增加，中性粒细胞数量增加，单核-巨噬细胞和淋巴细胞亚群增加。常见的细胞因子包括IL-6、IL-1β、IL-18、IL-10等，有助于更有针对性地研究急性肺损伤的发病机制。中性粒细胞数量的增加可以通过测定支气管肺泡灌洗液里的中性粒细胞弹性酶或髓过氧化物酶的含量或活性来反映。通常采用蛋白质印迹法，酶联免疫吸附法，蛋白质电泳或流式细胞仪等方法来测定上清液中酶的含量。但是需要注意的是，测量酶的水平与活性是有区别的，酶的水平可以反映中性粒细胞的数量，而酶的活性代表了活化细胞释放的酶的蛋白水解作用[34]。此外在不同的急性肺损伤模型中，炎症反应的细胞可能不止中性粒细胞，故对单核细胞- 巨噬细胞和淋巴细胞亚群的测定是一种补充[35]。测定炎症反应，其优点是便于研究具体病理生理机制，缺点是可能不具有明显的急性肺损伤特征性。

4.4 生理功能障碍评价

与肺部生理功能障碍最相关的方面是动脉血气测量，其次是肺顺应性和弹性的变化，和肺泡液的清除率。小型动物需要特定的血气分析仪或者脉搏血氧仪来分析血气，但受到实验室条件的限制往往不常用。肺顺应性的变化包括死腔量、气道阻力，肺阻力，肺总量，吸气末肺容量，和肺不张的变化等，可以通过强制振荡技术来测量，但也不常用[36]。相对常用的方法是测定肺泡液清除率，可以用通过单指示剂或双指示剂稀释技术来测量[37]。需要注意的是，临床上急性呼吸窘迫综合征的生理功能障碍主要表现在影像学中，故目前正在开展针对小型动物的成像技术的研究，包括微型计算机断层扫描，小动物磁共振成像，小动物肺部超声等[38]。

5 急性肺损伤动物模型的应用

因为动物模型可在一定程度上模拟急性呼吸窘迫综合征患者的肺部环境，所以可以用于研究改善临床上原有的治疗方案。比如，Monsel等[39]发现静脉输注人脐带来源的间充质基质细胞可能有助于改善新冠肺炎引起的早期急性呼吸窘迫综合征。Adrover等[40]发现双硫仑不仅可以用于醒酒，还可能通过阻止中性粒细胞胞外诱捕网的形成来有效抑制重症新冠肺炎患者在急性肺损伤时期的肺部炎症级联反应。这些关于急性呼吸窘迫综合征的研究和发现，都能为未来在不同领域探索新的治疗方向作出贡献。

6 展 望

本文探讨了不同免疫缺陷鼠的特点，介绍了多种急性肺损伤模型的建立方法及其评价方法。进行急性肺损伤实验时，应根据研究目的，实验条件以及模型特点来选择合适的建模方式和评价方法。总而言之，动物模型是研究的基础，也是后续评估急性肺损伤的动力学、放射学、生理学以及组织学等方面的关键，因此建立合适的动物模型对于研究急性呼吸窘迫综合征的发病机制具有重要意义。在设计实验时，必须仔细考虑动物模型的目的性和局限性，这样才有可能在未来进一步改善细菌，病毒感染等各种机制导致的急性呼吸窘迫综合征患者的临床治疗策略。