蜚蠊提取液改善阴道微生态及治疗宫颈持续性高危型人乳头瘤病毒感染的研究

林 艳， 王福菊， 胡佳贞， 许 岚， 张 鑫， 张忻佩， 赵蕴芝， 樊伯珍

(1. 上海中医药大学附属普陀医院妇产科，上海 200062； 2. 海军军医大学第二附属医院生殖医学中心，上海 200003)

高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillo-mavirus， HR-HPV)是一组古老的微小无包膜病毒，HR-HPV的持续感染是导致组织癌变的必要因素[1]。宫颈位于阴道微生态环境中，阴道作为抵御病原体入侵及防止下生殖道感染的重要防线，其微生态的平衡状态是防止HR-HPV感染乃至宫颈发生病变的重要条件[2]。对于宫颈持续性HR-HPV感染，西医以祛除受染病灶及辅助免疫治疗为主。干扰素虽为临床常用药物，但其转阴率并不能让人满意。中医将HR-HPV感染导致的宫颈相关症状归属于“带下病”，局部多表现为湿热阻滞之象。蜚蠊为血肉有情之品，在清热利湿、调畅局部气血方面效果尤为突出，且相关药理学研究表明，蜚蠊尚有抗病毒、调节菌群及免疫应答，甚至抗癌之功。本研究在干扰素阴道纳入用药的基础上加以蜚蠊提取液阴道冲洗对宫颈持续性HR-HPV感染患者进行治疗，观察分析两组患者用药的治疗效果、用药前后阴道微生态指标及宫颈局部细胞免疫功能的变化情况，试图探讨蜚蠊提取液的疗效及作用的可能途径，为临床中西医结合治疗宫颈持续性HR-HPV感染提供用药依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2021年5月—2022年2月在上海中医药大学附属普陀医院宫颈专科门诊就诊的宫颈持续性HR-HPV感染患者80例，按1∶1的比例随机分配为研究组和对照组，其中研究组1例复诊时因拒绝复查HR-HPV并只要求继续用药而剔除，对照组1例因离沪失访，最终共78例完成临床治疗及治疗后随访。两组患者在年龄、绝经情况、顺产次数及宫颈病变程度方面差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 研究组和对照组一般资料比较

1.2 纳入及排除标准

1.3 治疗方法

对照组： 患者在月经净后第3天起开始用药，睡前将重组人干扰素α-2b阴道泡腾胶囊(辛复宁： 800 000 IU/粒，上海华新生物高技术有限公司，S20050075)放置在阴道后穹隆，每晚1次，每次1粒，连续使用10 d为1个疗程，下一个月经周期同法使用，对于绝经患者于每个月固定同一时间用药，共3个疗程。研究组： 受试者干扰素使用方法同对照组，于第11天开始单独使用蜚蠊提取液(100 mL/瓶，四川好医生攀西药业有限责任公司，Z51021834)，每次25 mL，加入75 mL生理盐水混匀后进行阴道冲洗，每晚1次，连续使用10 d，两药序贯使用20 d为1个疗程(序贯疗法： 按顺序连续治疗。此处特指辛复宁先使用10 d后，立即进行蜚蠊提取液10 d治疗。)，下一周期同法使用，共3个疗程。研究获上海市普陀区中心医院伦理委员会同意(伦理审查批件号为PTEC-A-2021-53-1)。

1.4 观察指标及获取数据方法

分别在治疗前后对观察指标宫颈感染HR-HPV阳性数、阴道微生态各评价指标、宫颈局部细胞免疫水平进行统计及测定，治疗前标本收集： 在月经净后3～7 d间或绝经患者就诊时取样，治疗后标本收集： 在3疗程结束后第一次行经净后3～7 d间或绝经患者用药后1周取样，取样前3 d内应避免性生活、阴道灌洗和(或)阴道用药。

1.4.1 样本HR-HPV DNA载量测定采用美国FDA批准的第二代基因杂交捕获法(HCⅡ)检测，载量≥1.0 pg/mL视为HR-HPV阳性。

1.4.3 宫颈局部细胞免疫功能测定 患者取截石位，采集者将窥阴器轻柔置于阴道，扩张以充分暴露宫颈。先取1支棉拭子清除宫颈口分泌物后，再用一次性采样拭子轻柔插入宫颈口，朝同一方向旋转5圈后停留片刻，而后将其缓慢取出。将采样拭子加入4 mL无菌生理盐水中混匀后4 ℃下离心(离心半径10 cm，1 000 r/min，5 min)，分离上清液，采用酶联免疫吸附法(ELISA)对CD4+T、CD8+T、TNF-α、IL-4及IL-6载量进行检测，试剂盒由上海研聆生物科技有限公司提供，操作参照说明书进行。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 治疗后宫颈HR-HPV转阴率

研究组宫颈感染HR-HPV转阴率为61.54%(转阴24例)，对照组转阴率为33.33%(转阴13例)，研究组转阴率高于对照组，差异具有统计学意义(χ2=6.221，P=0.013)。

2.2 阴道微生态评价指标

分别对治疗前后两组显微镜下及干化学指标进行评价，内容主要包括阴道微生态失衡、LBG异常、加德纳菌/拟杆菌、形似动弯杆菌、革兰阴性短杆菌、革兰阳性球菌、pH值异常、H2O2阳性、LE阳性、SNA阳性、BV、AV检出情况。

2.2.1 显微镜下比较 两组治疗前比较，阴道微生态失衡、LBG异常、加德纳菌/拟杆菌、形似动弯杆菌、革兰阴性短杆菌、革兰阳性球菌、BV、AV检出情况差异无统计学意义(P>0.05)；研究组治疗前后比较，阴道微生态失衡(χ2=6.642，P=0.010)、LBG异常(χ2=6.271，P=0.012)、革兰阴性短杆菌(χ2=7.508，P=0.006)、革兰阳性球菌(χ2=8.419，P=0.004)及AV检出(χ2=4.255，P=0.039)等方面治疗后明显改善，与治疗前存在显著性差异；对照组治疗前后比较以上指标差异均无统计学意义(P>0.05)。研究组与对照组治疗后比较，研究组微生态失衡情况的改善明显优于对照组(χ2=4.446，P=0.035)，见表2。

表2 研究组和对照组阴道微生态显微镜下比较

2.2.2 干化学比较 两组治疗前比较，在pH值异常、H2O2阳性、LE阳性、SNA阳性方面差异均无统计学意义(P>0.05)。两组治疗后，以上指标差异仍无统计学意义(P>0.05)。研究组治疗前后比较，pH值异常(χ2=4.198，P=0.040)、H2O2阳性(χ2=5.769，P=0.016)治疗后明显改善(P<0.05)；对照组治疗前后比较仅pH值异常有改善(χ2=7.429，P=0.006)，见表3。

表3 研究组和对照组阴道微生态干化学比较

2.3 宫颈局部细胞免疫

两组治疗前比较，在CD4+T、CD8+T、CD4/CD8、TNF-α、IL-4及IL-6方面差异均无统计学意义(P>0.05)；两组治疗后，研究组比对照组在CD4(t=-4.741，P<0.001)、CD8(t=-4.725，P<0.001)、CD4/CD8比值(Z=-5.022，P<0.001)、TNF-α(t=-4.912，P<0.001)、IL-4(t=-2.162，P=0.034)方面差异均有统计学意义(P<0.05)；研究组治疗前后比较，CD4(t=-8.874，P<0.001)、CD8(t=7.246，P<0.001)、CD4/CD8比值(Z=-5.261，P<0.001)、TNF-α(t=11.213，P<0.001)、IL-4(t=4.945，P<0.001)及IL-6(t=2.533，P=0.016)方面差异均有统计学意义(P<0.05)；对照组治疗前后比较，CD4(t=-4.11，P<0.001)、CD4/CD8比值(Z=2.679，P=0.007)、TNF-α(t=-4.885，P<0.001)方面差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 研究组和对照组宫颈局部细胞免疫功能比较

3 讨 论

宫颈在中医中被称作“子门”，是连接阴道和子宫的通道，对于通畅上下气血、阻碍病邪入侵具有重要意义。根据临床研究统计[4]，宫颈HR-HPV持续感染者的体质以湿热质最甚，并极大比例表现为湿热内蕴证候。HR-HPV对宫颈的持续感染实际上为湿热瘀阻子门的一种特殊状态。宫颈HR-HPV的持续感染目前已被证实与宫颈癌的发生有直接联系[5]。因此，预防及治疗宫颈HR-HPV的持续感染对防止宫颈癌的发生意义重大。目前对HR-HPV感染的预防临床已有疫苗可以使用，但仍不能覆盖所有高危型HPV，且普及尚有时日。而西医治疗包括免疫、药物及局部手术，免疫治疗虽是目前抗病毒的重点[6]，但无论是治疗性疫苗还是免疫佐剂，其研发应用仍有待漫长的时日，现有的抗病毒药物的治疗作用有限，局部消融及手术仅能做到对受染组织的部分祛除，而对于散在分布的游离病毒却束手无策。干扰素作为人体内重要的细胞因子，可通过调节机体免疫功能以发挥抗病毒及抑制细胞异常增殖的作用，是目前用于宫颈HR-HPV持续感染的局部治疗的主要药物，但治疗后HR-HPV的转阴率较低，故干扰素在临床常作为基础用药使用，并辅以其他药物或物理治疗以提高对病毒的清除效果[7]。本研究在对宫颈HR-HPV持续感染患者采用干扰素纳阴的基础上加以蜚蠊提取液阴道冲洗，经3个疗程治疗后，较单用干扰素的对照组病毒转阴率明显提高(61.54%vs33.33%)，提示两者的协同或蜚蠊提取液增强了干扰素对持续性HR-HPV感染的治疗作用。蜚蠊提取液以虫类中药蜚蠊为主要成分，是清利湿热，活血解毒之品。《神农本草经》载蜚蠊：“主血瘀，癥坚，寒热。破积聚，喉咽闭，内寒无子。”因其为血药，故尤适用于女性。在宫颈HR-HPV持续感染早期，患者多以带下黄稠等局部湿热证候为主，而尚未见明显的全身证候。蜚蠊性味咸寒，有清利、活血之功，又因其生于阴湿之地，故可主带下病之寒热，恰适用于宫颈HR-HPV的早期感染。目前，蜚蠊提取液因其良好的创面修复作用[8]而广泛应用于临床，这种对黏膜的修复作用可预防HR-HPV经受损阴道黏膜入侵基底层上皮细胞，从而阻断感染的发生。此外，蜚蠊提取液尚被报道具有抗菌、抗病毒、免疫调节甚至抗癌之效能[9]。过去已有将蜚蠊提取液用于抗宫颈HR-HPV感染的随机对照研究[10-11]，并显示出较好的HR-HPV转阴效果，但其观察指标多集中于疗效及全身免疫功能的观察，却较少对阴道微生态改善情况及宫颈局部细胞免疫功能做出相关分析。

在本研究中，研究组的病毒转阴率与阴道微生态平衡的恢复同步提升，提示蜚蠊提取液可能通过其清利湿热，活血解毒之功效，促进阴道微生态的功能修复，同时提示阴道微生态失衡与HR-HPV持续感染的高度相关性。阴道微生态由阴道菌群、局部免疫、内分泌及解剖结构四部分组成，其中又以菌群结构及免疫功能表现出较大的可变性。乳杆菌作为正常阴道中的主要优势菌种，其数量与HR-HPV载量[12]及宫颈上皮内病变进展[13]呈负相关。Antonio等[14]通过比较不同乳杆菌的H2O2分泌能力发现，分泌H2O2能力强的加氏乳杆菌所主导的菌群结构具有更快的病毒清除率，提示了HPV感染风险的增加与H2O2分泌不足存在关联。本组资料中，干扰素加用蜚蠊提取液治疗后，随着HR-HPV的被清除，阴道内H2O2阳性数明显低于治疗前，也佐证了这一观点。另一方面，在正常的内分泌环境下，乳杆菌分解细胞内糖原产生乳酸，通过降低局部pH值以维持正常阴道酸性环境。若乳杆菌的质量下降，或是优势菌的地位受到动摇，则将导致阴道菌群紊乱并由此引发一系列炎症反应。根据现有研究报道，HR-HPV感染者以BV及AV为最常见的菌群失调状态，同时也是乳杆菌质量下降的另一种表现形式[15]。近期有研究显示，AV的发生或许较BV在宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的进展中更为重要[16]。本研究中，HR-HPV感染者拥有很高的阴道微生态失衡率(76.92%，84.61%)，其中LBG为Ⅱb或Ⅲ级者达半数以上(58.97%，56.41%)，pH异常占61.54%及66.67%，提示了极其糟糕的阴道乳杆菌结构及功能。且在治疗前患者阴道中革兰阴性短杆菌拥有很高的检出率(71.79%，66.67%)，AV感染接近半数(53.85%，48.72%)，表现出明显的需氧菌倾向，提示了其可能为宫颈HR-HPV持续感染的有利条件，也为临床精准治疗提供了依据。王璐等[17]使用阴道乳杆菌制剂联合干扰素治疗宫颈HR-HPV感染，结果不仅出现阴道微生态失衡状态的好转，且其病毒转阴率也远高于单用干扰素组，提示通过恢复以乳杆菌为优势菌的阴道微生态环境对HR-HPV清除的可行性。一项针对HR-HPV感染的荟萃分析显示，局部应用乳杆菌制剂或将是一种可行的促进HPV清除的介入性方法[18]。研究组在使用蜚蠊提取液与干扰素治疗后，这类指标较单用干扰素治疗得到明显改善，不排除蜚蠊提取液清利湿热，活血解毒的药物特性，通过改善阴道内正常优势乳杆菌的菌群结构及功能而发挥作用的可能性，但由于研究样本数及观察时间的不足，对其确切发挥作用的途径尚难明确。

宫颈与阴道本为一体，因处于同一微生态环境中，故宫颈局部免疫虽与阴道免疫相区别但又存在极大的相似性，皆与阴道菌群存在相互关联。以T淋巴细胞为主导的细胞免疫是宫颈局部免疫的重要组成部分，主要分为CD4+T细胞及CD8+T细胞两大类。CD4/CD8平衡的保持对抑制宫颈肿瘤发生具有重要意义，研究显示[19]，CD4+T细胞减少及CD4/CD8比值的下降常预示着宫颈病变进展甚至癌变等不良结局。CD8+T细胞主要介导细胞毒性作用；而CD4+T细胞通过分化为辅助T(Th)细胞1、Th2及调节性T(Treg)细胞进一步调节免疫应答。Th1/Th2作为衡量免疫功能的又一对重要指标[20]，二者的分子程序具有相互对立性，其平衡的偏移意味着机体免疫功能的紊乱。其中Th1细胞可通过分泌IL-2、IFN-γ等多种细胞因子以增强细胞免疫功能。IL-4作为Th2分泌的重要免疫因子，对正常的免疫应答具有阻断作用；TNF-α可介导嗜酸性细胞释放炎症介质，IL-6则进一步趋化中性粒细胞，使得局部炎症损伤程度进一步加重。也有研究显示阴道菌群可与宫颈局部免疫功能相互作用，保护宿主免受病毒感染，从而减少宫颈癌的发生[21]。本研究结果显示，研究组CD4+T细胞、CD4/CD8较前明显上升，CD8+T细胞、TNF-α、IL-4、IL-6则明显下降，而对照组仅在CD4+T细胞、CD4/CD8及TNF-α方面较治疗前有所改善。两组比较，研究组免疫调节作用显著优于对照组，且阴道微生态环境得到明显改善，提示了蜚蠊提取液对宫颈细胞免疫功能的改善作用，这种宫颈免疫应答的修复有助于对持续性HR-HPV感染的清除，这或许是蜚蠊提取液其发挥抗病毒作用的重要机制。

综上所述，宫颈持续性HR-HPV感染者多伴随明显的阴道微生态失衡，主要表现为乳杆菌质与量的下降及由此引发的阴道微生态指标异常及宫颈细胞免疫功能紊乱。蜚蠊提取液以其清利湿热，活血解毒功效，与干扰素联用可显著提高对宫颈持续性HR-HPV感染的清除效果，同时较好地改善了阴道菌群紊乱状态及宫颈局部细胞免疫功能，促进了宫颈阴道微生态的恢复。但由于临床观察时间较短，药物的远期疗效还需要进一步随访，以及实验室条件限制，没对HR-HPV做详细分型治疗效果分析。也由于受到伦理的限制，本研究未能单独使用蜚蠊提取液对宫颈持续性HR-HPV感染治疗做出相应指标的观察，有待后续进一步研究。