响应面法优化黑皮鸡枞总黄酮提取工艺

张晨，赵金，严俊杰，苗人云，林俊彬，李翔，周向荣，张攀，甘炳成*

(1.中国农业科学院都市农业研究所，成都 610213；2.成都大学 食品与生物工程学院，成都 610106；3.成都农业科技中心，成都 610213；4.金堂县现代农业装备产业园管理委员会，成都 610407；5.四川田岭涧生物科技发展有限公司，成都 610400)

黑皮鸡枞(Oudemansiellaraphanipes)又名卵孢小奥德蘑、长根菇，是一种适合工厂化栽培的高端珍稀食用菌[1-4]。黑皮鸡枞香味浓郁、口感鲜嫩，不仅富含人体所需的蛋白质、脂肪、氨基酸，还含有多糖[5-7]、黄酮[8]等多种活性成分，而且具有极高的食用和药用价值。目前，黑皮鸡枞主要是以鲜品食用为主，包括炒菜、煲汤等，其子实体含有多种鲜味氨基酸、5′-核苷酸，具有成为天然健康型调味品原料的潜能[9]。

黄酮类化合物广泛存在于各种食用菌中，具有抑菌、抗氧化、预防骨质疏松、抗过敏等功效[10-13]，因而受到研究者及健康产品开发人员的广泛关注。然而，目前关于黑皮鸡枞中黄酮的提取工艺研究较少且提取效率较低。基于此，本试验拟采用单因素试验和响应面法进行工艺优化，利用超声波辅助乙醇法探索从黑皮鸡枞中提取总黄酮的工艺条件，以期获得一种操作简单、提取率高的总黄酮提取工艺，为黑皮鸡枞总黄酮的开发利用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑皮鸡枞子实体：中国农业科学院都市农业研究所栽培基地；芦丁：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇：成都市科隆化学品有限公司；亚硝酸钠、氢氧化钠、九水硝酸铝：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

WP-UP-LH-20S理化分析型超纯水机 四川沃特尔水处理设备有限公司；WGLL-125BE电热鼓风干燥箱、FW177中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；TX323L电子天平 岛津菲律宾制造有限公司；FlexA-200酶标仪 杭州奥盛仪器有限公司；SB25-12DTD超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 黄酮提取工艺

黑皮鸡枞子实体→烘干→粉碎→过筛(40目筛)→黑皮鸡枞粉末→称量→加入提取溶剂→超声辅助提取→过滤→定容→测定黄酮。

1.2.2 黄酮标准曲线的制作

以芦丁作为标准品，参考孙琼[14]的方法进行黄酮的测定。以芦丁对照品溶液的质量浓度(μg/mL)为横坐标、吸光度(OD)值为纵坐标，得标准曲线方程y=0.0016x-0.0031，相关系数R2=0.9929。

1.2.3 黑皮鸡枞总黄酮含量的测定

准确称取1.00 g黑皮鸡枞粉末，在一定体积、浓度的乙醇溶液基础上，添加一定料液比的蒸馏水。通过功率300 W的超声波处理，按照不同的超声时间、超声温度提取黑皮鸡枞总黄酮，过滤后收集提取液，定容至50 mL，摇匀，每组试验重复3次。移取2 μL溶液至96孔板中，按照孙琼的方法测定其吸光度，计算黑皮鸡枞总黄酮的提取率，公式如下：

W=C×V/1000m×100%。

式中：W为黑皮鸡枞菌总黄酮提取率(mg/g)；C为提取液中总黄酮的质量浓度(μg/mL)；V为供试总黄酮样品液体积(mL)；m为黑皮鸡枞粉末质量(g)。

1.2.4 单因素试验

在1.2.1的提取工艺下，准确称取黑皮鸡枞粉末1.00 g，将黑皮鸡枞总黄酮提取率作为指标，通过单因素试验探究乙醇浓度(50%、60%、70%、80%、90%)、液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1)、超声时间(30，60，90，120，150 min)、超声温度(40，50，60，70，80 ℃)4个因素对黑皮鸡枞菌总黄酮提取率的影响，并筛选出各因素的最适范围，为响应面法优化试验做好水平选取，每组试验重复3次。

1.2.5 黑皮鸡枞总黄酮提取工艺优化

采用Design Expert 8.0.6.1软件，在单因素试验基础上，采用四因素三水平响应面试验，对黑皮鸡枞总黄酮的提取率进行响应面设计，因素水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平

1.3 数据处理

每组试验处理重复3次，结果用平均值±标准差表示，采用Excel 2020、Design Expert 8.0.6.1和SPSS进行数据统计和分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同乙醇浓度对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响

由图1可知，为探究不同乙醇浓度对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响，选择50%～90%乙醇浓度进行试验。乙醇浓度从70%增加到80%时，提取率显著提高，从2.28 mg/g提高到3.69 mg/g，可能是由于黑皮鸡枞总黄酮的极性与乙醇极性接近[15]。但当乙醇浓度超过80%时，黑皮鸡枞总黄酮提取率呈现降低趋势，可能是因为黑皮鸡枞中其他醇溶性杂质浸出的比例升高，降低了黄酮的溶解[16]。因此，选择乙醇浓度为80%。

图1 乙醇浓度对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响

2.1.2 不同液料比对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响

由图2可知，液料比对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响先增加后减小。当液料比在20∶1～40∶1 (mL/g)的范围内时，黑皮鸡枞总黄酮提取率显著上升，这可能是接触面积增加产生的结果。当液料比为40∶1～60∶1 (mL/g)时，黑皮鸡枞总黄酮提取率缓慢下降，因为黑皮鸡枞总黄酮溶出完全，且可能会造成其他杂质的溶出，抑制了总黄酮的提取[17]。因此，选择液料比为40∶1 (mL/g)。

图2 液料比对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响

2.1.3 不同超声时间对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响

由图3可知，超声时间对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响先增加后减少。因为超声时间增加会导致黑皮鸡枞的细胞膜破坏程度增大，细胞膜内外会形成梯度差，有利于总黄酮类物质向乙醇溶液中扩散，因此提取率会增加[18]。当超声时间为120 min时，黑皮鸡枞中提取的总黄酮含量达到最大值4.08 mg/g。当超声时间高于120 min时，黄酮具有的酚羟基会发生化学反应，导致总黄酮提取率下降[19]。因此，选择超声时间为120 min。

图3 超声时间对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响

2.1.4 不同超声温度对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响

由图4可知，超声温度对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响较为明显。当超声温度在40～70 ℃范围内时，由于超声温度显著增加，小分子间流动加快，有利于黑皮鸡枞总黄酮的溶出。当超声温度在70～80 ℃范围内时，黑皮鸡枞的总黄酮溶出急剧减少。这可能是由于乙醇本身易挥发，温度过高，黑皮鸡枞总黄酮发生氧化分解，同时乙醇浓度加速降低，导致提取率陡然下降[20]。因此，选择超声温度为70 ℃。

图4 超声温度对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响

2.2 黑皮鸡枞菌总黄酮提取响应面试验

2.2.1 响应面试验设计与结果

以总黄酮提取率为响应值，使用Design Expert 8.0.6.1软件进行Box-Behnken试验设计，结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果

根据Design Expert 8.0.6.1软件对表2中数据进行回归分析。4个因素的编码值二次回归方程为：Y=4.82+0.45A+0.33B-0.17C-0.10D-7.500E-003AB-2.500E-003AC+0.14AD+0.21BC+0.20BD-0.28CD-0.99A2-0.64B2-0.56C2-0.34D2。

2.2.2 响应面回归模型方差分析

通过Design Expert 8.0.6.1软件进行方差分析，结果见表3。

表3 回归模型方差分析

由表3可知，模型的P值<0.0001，表明模型显著。失拟项的P值=0.0550>0.05(不显著)，说明该模型误差小。R2=0.9070，RAdj2=0.8141，说明模型拟合度较高，有18.59%的情况该模型无法解释[21-23]。其中A、A2、B2、C2高度显著地影响黑皮鸡枞总黄酮提取率(P<0.0001)；B极显著地影响黑皮鸡枞总黄酮提取率(P<0.01)；D2显著地影响黑皮鸡枞总黄酮提取率(P<0.05)；其余因素对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响不显著。根据F值与P值的大小分析，试验范围内各因素对总黄酮提取率的影响大小为A(乙醇浓度)>B(液料比)>C(超声时间)>D(超声温度)。

2.2.3 响应面分析

为考察各因素交互作用对黑皮鸡枞总黄酮提取率的影响，采用Design Expert 8.0.6.1软件绘制响应面图，见图5。响应面平面图中，若等高线为圆形，则两因素之间的交互作用较弱；若等高线为椭圆形，则两因素之间的交互作用较强[24]。

图5 各因素交互作用对总黄酮提取率影响的响应面图及等高线

由图5可知，黑皮鸡枞总黄酮提取率的优化工艺条件中各因素等高线趋于圆形，结合模型方差分析结果，各因素的交互作用相对较弱(P>0.05)[25]。

2.2.4 验证试验

根据上述分析，发现各因素间的响应面和等高线与回归方程分析结果吻合，根据Design Expert软件预测的结果，得到黑皮鸡枞总黄酮最优提取参数。结果显示：乙醇浓度82.30%、液料比42.44∶1、超声时间116.68 min、超声温度70.15 ℃时，黑皮鸡枞总黄酮提取率预测值为4.91767 mg/g。结合理论预测和实际应用，优化结果表明，以82%乙醇为溶剂，42∶1 (mL/g)液料比处理117 min，超声辅助提取总黄酮，重复3次试验，黑皮鸡枞总黄酮提取率平均值为4.89 mg/g。利用选定的最优条件检验模型方程预测最优响应值的适用性，结果吻合度较高，表明该优化工艺具有稳定性和可行性。

3 结论

本研究采用超声辅助乙醇法，以最大限度地提高黑皮鸡枞中总黄酮的提取率。通过Box-Behnken响应面设计，对乙醇浓度、液料比、超声时间和超声温度4个参数进行了优化，得到最佳提取条件：乙醇浓度82%，液料比42∶1 (mL/g)，超声时间117 min，超声温度70 ℃。此条件下黑皮鸡枞总黄酮提取率达到4.89 mg/g。该方法的黄酮提取量高且方法简单，为黑皮鸡枞黄酮在食药用品、功能性调味品方面的应用奠定了基础，提高了黑皮鸡枞的附加价值。