利用沼虾废弃物制备富含虾青素的食用油和虾露调味液的工艺研究

钱建瑛，王雨露，李恒，王元才，陈学义，史劲松*

(1.江南大学,江苏 无锡 214122；2.高邮市元鑫冷冻有限公司,江苏 扬州 225600)

淡水虾是我省传统养殖品种，其中，罗氏沼虾作为高产、优质特色品种，其养殖量占全国一半以上[1]，高邮地区是沼虾养殖的集中区，养殖量占全省的60%，仅里下河地区各种淡水虾年养殖量就达10万吨以上，社会综合产值在50亿元以上[2]。但与产业集群不相适应的是配套的加工业发展滞后，显著存在加工品比例低、高附加值产品少、技术含量低、废弃物多等共性问题[3]，亟待研发精深加工及高效利用技术，开发新型优质深加工产品。

罗氏沼虾头部大，虾仁加工过程中的剩余物较多，约占35%以上，这些边角料作为加工废弃物可能对环境造成污染，目前的处理方法是用作饲料、肥料、甲壳素的生产原料等。利用先进的加工设备、分离技术、生物技术，可以对虾头、虾壳中一些营养价值高的物质进行提取分离，进而加工成高附加值的食品或配料，如虾黄，含有大量的不饱和脂肪酸，不仅味道鲜美，而且含有较多的虾青素[4]，如果能够进行有效分离，则可以获得高虾青素的虾油产品。由于不饱和脂肪酸、虾青素相对含量低，且容易变质，因此需要在较为温和的条件下进行提取。虾头、虾壳中还含有一些结构性蛋白，与虾壳结合紧密，不容易剥落，但可以采用蛋白酶进行水解，通过生物抽提予以提取。将这些虾头、虾壳中残留的蛋白进行回收，可以制备风味优美的虾肽调味品[5]。因此，本研究以罗氏沼虾加工废弃物虾头、虾壳为原料，通过生物酶法和超声波辅助法提取虾青素；以蛋白水解物为原料，通过热反应增香，获得虾露风味的调味液；将虾头、虾壳废弃物中的脂质和蛋白质充分利用，拓展了沼虾精深加工技术，减少了资源浪费。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜沼虾虾头、虾壳：高邮市元鑫冷冻有限公司；木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶：南宁东恒华道生物科技有限责任公司；中性蛋白酶、碱性蛋白酶：江苏博立生物科技有限公司；花生油、大豆油、葵花籽油：金太阳粮油股份有限公司；甲醇、乙腈、二氯甲烷(均为色谱纯)：赛默飞世尔科技公司；虾青素标准品(HPLC≥98%)：北京索莱宝科技有限公司；其他试剂：国药集团化学试剂(上海)有限公司。

1.2 试验仪器

SHJ-4A磁力搅拌水浴锅 常州金坛良友仪器有限公司；KQ500E超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；20R离心机 美国贝克曼库尔特公司；L2000液相色谱仪 日本日立公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

以沼虾废弃物虾头、虾壳为原料，通过添加蛋白酶有效降解和虾青素结合的蛋白质，实现脂质的较好分离，通过超声波辅助萃取，用食用油在较低温度下萃取，减少虾青素的氧化损失；蛋白水解物进一步通过美拉德反应增香消除不良风味，并通过复配提高感官指标，最终获得富含虾青素的食用油和虾露调味液两种产品。

1.3.2 样品处理

将沼虾加工中剥除的虾头、虾壳用清水洗涤2～3次，沥干后称重，按料液比1∶1加入纯水，粉碎打浆。

1.3.3 酶解工艺

分别按虾头、虾壳质量的2.5%、5.0%、10.0%、20.0%加入木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶，水浴35，40，45，50，55 ℃下酶解2，3，4，5，6 h。考察蛋白酶种类、加酶量、酶解温度和时间对虾青素得率的影响。

1.3.4 超声辅助萃取工艺

将酶解液用纱布过滤，按滤液体积1∶1分别加入花生油、葵花籽油和大豆油，以超声功率100，200，300，400，500 W辅助萃取10，20，30，40，50 min，离心取油层，得到富含虾青素的食用油。考察萃取用食用油的种类、超声功率、萃取时间对虾青素得率的影响。

1.3.5 美拉德反应增香及复配工艺

将1.3.4离心后的水层进行美拉德反应，按酶解液体积添加5%还原糖(木糖、葡萄糖、果糖、蔗糖)、1%氨基酸(天冬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸)和0.3%抗坏血酸进行美拉德反应，分别以95，100，105，110，115，120 ℃反应10，20，30，40，50，60 min，考察还原糖、氨基酸的种类、反应温度和时间对反应产物风味的影响；在美拉德反应产物中添加0.5%核苷酸二钠、5%谷氨酸钠、5%食盐、1%麦芽糊精以及1%白砂糖，制成虾露调味液，考察调味对终产品感官评价的影响。

1.3.6 虾青素含量的检测方法

采用高效液相色谱法检测食用油中虾青素的含量，色谱柱：Waters XBridge BEH C18(4.6 mm×250 mm×5.0 μm)，流动相为乙腈∶二氯甲烷∶甲醇∶水为5∶5∶85∶5，流速：1.0 mL/min，检测波长：470 nm，进样量：10 μL，柱温：25 ℃[6]。

虾青素标准曲线的测定：准确称取虾青素标准品2.5 mg，加入5 mL二氯甲烷和0.1 mol/L氢氧化钠-甲醇溶液5 mL，充分混匀后避光4 ℃静置12 h待皂化完全。定容至25 mL，得到浓度为100 μg/mL的母液。分别量取0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 mL，定容至50 mL，用0.45 μm滤膜过滤后进样，根据峰面积和样品浓度计算标准曲线。

根据高效液相色谱法测得的峰面积与浓度的线性方程为y=38727x+216604，R2=0.9998，结果表明虾青素在1～16 μg/mL范围内线性关系良好(见图2)，该标准曲线可用于本试验所提取到的虾青素含量的确定。

图2 虾青素标准曲线

样品制备方法：准确称取0.5 g根据1.3.4制备的富含虾青素的食用油，加入5 mL二氯甲烷和0.1 mol/L氢氧化钠-甲醇溶液5 mL，充分混匀后避光4 ℃静置12 h待皂化完全，用0.45 μm滤膜过滤后进样，根据峰面积和标准曲线计算样品中虾青素的含量。

1.3.7 感官评定方法[7]

在60 ℃的温水中加入10%的虾露调味液，搅拌均匀。邀请经过训练、有评定经验的10位感官评定员(5男5女)进行品评。简单描述法：感官评定员对构成样品特征的各个指标进行定性描述，尽量完整地描述出样品的品质。评分检验法：评定员根据样品的咸味、鲜味、醇厚味、甜味、酸味、苦味、焦糊味、腥味进行评定，采用10分制，将添加了0.5%核苷酸二钠、5%谷氨酸钠、5%食盐、1%麦芽糊精以及1%白砂糖的空白液作为对照溶液设定为0分，分值越高表明感官刺激越强，逐项评分后进行分析。

2 结果与分析

2.1 富含虾青素的食用油的制备

2.1.1 蛋白酶种类对虾青素得率的影响

按虾头、虾壳质量的5.0%加入木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶，水浴45 ℃下酶解5 h，蛋白酶种类对虾青素得率的影响见图3。

图3 蛋白酶种类对虾青素得率的影响

由图3可知，不同种类的蛋白酶酶解对虾青素的提取得率具有不同的效果，采用木瓜蛋白酶酶解后，虾青素的得率最高。虾青素为脂溶性物质，游离型的虾青素可以采用低极性溶剂或油脂进行萃取；但在虾壳中大多数虾青素与蛋白质、甲壳素形成结合型复合物，无法直接萃取，得率较低；采用蛋白酶酶解后，虾青素与蛋白质分解开，更易于溶剂萃取[8]。木瓜蛋白酶可以水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，同时还能选择性降解甲壳素的GlcNAc-GlcN糖苷键，因此能获得更高的虾青素得率[9]。

2.1.2 蛋白酶用量对虾青素得率的影响

按虾头、虾壳质量的2.5%、5.0%、10.0%、20.0%加入木瓜蛋白酶，水浴45 ℃下酶解5 h，木瓜蛋白酶用量对虾青素得率的影响见图4。

图4 木瓜蛋白酶用量对虾青素得率的影响

由图4可知，当木瓜蛋白酶添加量较低时，虾青素得率随着木瓜蛋白酶的增加而提高；当木瓜蛋白酶添加量达到5.0%时，虾青素得率达到最高值(87.2 μg/g)；进一步增加木瓜蛋白酶用量时，虾青素得率不再提高，甚至略有下降，这是因为当酶添加量增加到一定程度时，所有可以和酶结合的底物都已经反应完全，并且过量的蛋白酶可能导致已经和虾青素分离的蛋白和多肽进一步水解，影响后续的萃取步骤，反而降低了虾青素的得率。

2.1.3 酶解温度对虾青素得率的影响

按虾头、虾壳质量的5.0%加入木瓜蛋白酶，水浴35，40，45，50，55 ℃下酶解5 h，不同酶解温度对虾青素得率的影响见图5。

图5 酶解温度对虾青素得率的影响

由图5可知，当酶解温度低于45 ℃时，虾青素得率随着温度的升高而增加，当酶解温度为45 ℃时达到最大值。这是因为温度的升高使酶解反应效率提高，当达到酶促反应的最适温度时，酶解效果最佳。继续升高酶解温度，不再适合酶解反应，同时可能引起虾青素氧化[10-11]，反而降低了最终得率。

2.1.4 酶解时间对虾青素得率的影响

按虾头、虾壳质量的5.0%加入木瓜蛋白酶，水浴45 ℃下酶解2，3，4，5，6 h。不同酶解时间对虾青素得率的影响见图6。

图6 酶解时间对虾青素得率的影响

由图6可知，虾青素提取量随着酶解时间的增加先上升，当达到5 h时得率达到最高值87.2 μg/g；这是因为随着时间的增长，酶的酶解效果发挥更充分，蛋白质和虾青素的分离程度更好，虾青素萃取后得率越高；继续增加酶解时间后虾青素提取量降低，可能是因为时间过长导致游离状态的虾青素发生氧化、变性。

续 表

2.1.5 萃取用食用油种类对虾青素得率的影响

已有的文献报道多采用有机溶剂对虾青素进行提取，如丙酮、二氯甲烷、正己烷、氯仿等[12]，有机溶剂沸点低，大多具有挥发性和毒性，可能引起食品安全问题。本文采用食用油萃取经过酶解、以游离形式存在的虾青素，获得食用安全、富含虾青素的营养油脂，因此考察常用的不同种类的食用油对虾青素萃取的影响，结果见图7。

图7 食用油种类对虾青素得率的影响

由图7可知，使用花生油萃取虾青素的提取量(87.2 μg/g)显著优于大豆油和葵花籽油。花生油含不饱和脂肪酸80%以上，还含有软脂酸、硬脂酸和花生酸等饱和脂肪酸，占19%左右，其特征在于所含十八碳以上的饱和脂肪酸比其他植物油脂多，推测可能是脂肪酸组成上的区别导致不同的植物油对虾青素的萃取效果有所差异[13]。

2.1.6 超声功率对虾青素得率的影响

将酶解液用纱布过滤，按滤液体积1∶1加入花生油，以超声功率100，200，300，400，500 W辅助萃取30 min，离心取油层，得到富含虾青素的食用油。考察不同超声功率对虾青素得率的影响，结果见图8。

图8 超声功率对虾青素得率的影响

由图8可知，随着超声功率的增大，虾青素得率先提高再降低。当超声功率增大至300 W时，超声波处理产生的空化效应增强，使虾壳中的蛋白质暴露更多的反应位点，酶促反应速率提高，从而提高了虾青素得率。当超声功率进一步增大时，可能会导致游离虾青素氧化增加而使得率下降。

2.1.7 萃取时间对虾青素得率的影响

将酶解液用纱布过滤，按滤液体积1∶1加入花生油，以超声功率300 W辅助萃取10，20，30，40，50 min，离心取油层，考察不同萃取时间对虾青素得率的影响，结果见图9。

图9 萃取时间对虾青素得率的影响

由图9可知，超声萃取时间适度延长时(10～40 min)，虾青素得率显著提高，可能是因为超声所产生的空化效应随着萃取时间的延长而不断加强，暴露了更多蛋白反应位点，使酶与底物结合更方便，酶促反应更迅速。当萃取时间为40 min时，虾青素得率最高，达到了97.8 μg/g。进一步延长超声时间时，可能使蛋白质疏水键大量暴露而发生凝集和沉淀，使酶解反而受阻，也有可能导致游离虾青素氧化而变质，从而降低了虾青素得率[14]。

2.2 虾露调味液的制备

酶解获得的水溶性部分富含呈味氨基酸、风味肽，同时夹杂有水产的腥味，因此通过美拉德反应增香[15]，以实现虾头、虾壳资源的完全利用。

2.2.1 还原糖种类对反应产物风味的影响

虾头、虾壳酶解液中含有大量氨基酸和短肽，是美拉德反应的重要前体物质，但只有它们参与还不足以产生良好的风味，因此通过试验考察添加不同的还原糖和氨基酸对美拉德反应增香效果的影响[16]。按酶解液体积添加5%还原糖(木糖、葡萄糖、果糖、蔗糖)、1%丙氨酸、0.3%抗坏血酸进行美拉德反应，110 ℃反应20 min，反应产物由感官品评员进行描述，结果见表1。

表1 还原糖种类对美拉德反应产物的影响

由表1可知，果糖与蔗糖不适宜在本反应中添加，葡萄糖与木糖产生的风味较好。木糖作为戊糖，其参与美拉德反应的速度较己糖(葡萄糖)更快，但价格较高，与之相比生产上使用葡萄糖更为经济，且产物风味无明显差异。

2.2.2 氨基酸种类对反应产物风味的影响

不同的氨基酸与还原糖反应，能够产生各自不同的特征风味，本试验选择了7种氨基酸参与反应，即天冬氨酸、精氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、谷氨酸。将1.3.4离心后的水层进行美拉德反应，按酶解液体积添加5%葡萄糖、1%氨基酸、0.3%抗坏血酸进行美拉德反应，110 ℃反应20 min，结果见表2。

表2 氨基酸种类对美拉德反应产物的影响

根据表2中感官品评员对美拉德反应产物的描述，在反应中添加丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸有助于美拉德反应增香，而天冬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和精氨酸不适合本反应。因此，将丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸以等比例(1∶1∶1)混合后的复合氨基酸作为美拉德反应的原料进行添加。

2.2.3 美拉德反应温度对产物风味的影响

将1.3.4离心后的水层进行美拉德反应，按酶解液体积添加5%葡萄糖、1%复合氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸以质量比1∶1∶1混合所得)、0.3%抗坏血酸进行美拉德反应，分别以95，100，105，110，115，120 ℃反应20 min，考察反应温度对产物风味的影响，结果见表3。

表3 反应温度对美拉德反应产物的影响

温度是影响美拉德反应的一个重要因素，温度过高，最终产物中杂味成分增多，并带有焦糊味，温度很高时还会导致炭化；温度过低，又使最终产物中特征香味较不明显。由表3可知，当反应温度为105 ℃时，产物的鲜味、醇厚味和甜味体现得更明显，而酸味、苦味、焦糊味，尤其是腥味不明显，说明反应温度的降低使产物明显减少，因此选择该反应条件。

2.2.4 美拉德反应时间对产物风味的影响

将1.3.4离心后的水层进行美拉德反应，按酶解液体积添加5%葡萄糖、1%复合氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸以质量比1∶1∶1混合所得)、0.3%抗坏血酸进行美拉德反应，105 ℃反应10，20，30，40，50 min，考察反应时间对产物风味的影响，结果见表4。

表4 反应时间对美拉德反应产物的影响

在相同的反应温度下，不同反应时间得到的产物是有差距的，时间过短，反应不完全，时间过长，产生过多的杂味物质。由表4可知，当反应时间为30 min时，反应产物带给感官品评员更优的嗅觉、味觉感受，其鲜味、醇厚味、甜味明显，而不良的感觉如酸味、苦味、焦糊味和腥味并不明显。

2.2.5 美拉德反应及调味对终产品风味的影响

为了使终产品更加鲜美可口，在美拉德反应液中添加0.5%核苷酸二钠、5%谷氨酸钠、5%食盐、1%麦芽糊精以及1%白砂糖，制成虾露调味液，感官品评员对酶解液、美拉德反应液和虾露调味液的评分结果见图10。

图10 酶解液、美拉德反应液及虾露调味液的风味描述

由图10可知，酶解液具有一定的鲜味、咸味，然而其腥味突出，同时稍具苦味和酸味；经过美拉德反应后，腥味显著降低，同时鲜味和醇厚味进一步增强，苦味和酸味也得到了调整；进一步复配后，虾露调味液中鲜味和醇厚味最突出，甜味，腥味、焦糊味、苦味和酸味都不明显，可见美拉德反应和调味获得了风味良好、可用于烹饪的虾味调味产品。

3 结果与讨论

虾头和虾壳中含有丰富的蛋白质和氨基酸，还有虾青素和甲壳素等，具有很高的利用价值。虾青素是一种橙红色类胡萝卜素，具有脂溶性，不易溶于水，易溶于有机溶剂，如三氯甲烷、丙酮、苯等。从虾废弃物中提取虾青素的方法主要包括油溶法、有机溶剂萃取法、超临界CO2萃取法、酶解法[17]。Hooshmand等[18]以虾废弃物为原料，用不同的有机溶剂提取虾中的虾青素,研究结果表明提取溶剂为丙酮时，提取到的类胡萝卜素含量最高，为(61.321±2.176) μg/g。孙兆远等[19]采用酶解处理鳌虾壳后，用丙酮萃取虾青素，得率可达到97.26 μg/g。在废弃物的蛋白质利用方面，王红丽等[20]采用酶解和热处理南美白对虾加工下脚料，获得了感官评分最高、挥发性风味物质成分与熟虾肉相近的产物；冯明会等[21]以克氏原螯虾虾头为主要原料，酶解后调配鲜辣椒等进行发酵，制成了香辣口味、风味物质含量丰富的虾酱调味品；任欣荣等[22]以甜面酱为基础，添加0.4%克氏原螯虾粉、白砂糖、食用油、芝麻等，获得香味浓郁、滋味鲜美、稠度适中的调味酱。以上加工方式都为虾头、虾壳的资源利用提供了思路，在此基础上，通过酶解、脂质提取、蛋白质和氨基酸调味、增香，可以将废弃物按营养成分进行分类利用，加工成为高附加值的食品或配料。

本研究以沼虾加工产生的废弃物虾头、虾壳为原料，通过添加5%的木瓜蛋白酶、45 ℃酶解5 h，可有效降解结合蛋白，实现虾青素和蛋白的较好分离；通过花生油萃取虾青素，采用300 W超声辅助萃取40 min，可以实现常温下脂类物质的回收，减少了虾青素的氧化损失，虾青素的提取率可达到97.8 μg/g；酶解液中含有大量氨基酸、风味肽，按酶解液体积添加5%葡萄糖、1%复合氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸按1∶1∶1混合)、0.3%抗坏血酸进行美拉德反应，105 ℃反应30 min，消除了不良风味，提高了感官指标；进一步在美拉德反应液中添加0.5%核苷酸二钠、5%谷氨酸钠、5%食盐、1%麦芽糊精以及1%白砂糖，制成了天然的虾味调味液，实现了资源的全值化利用。