四川麸醋发酵过程中有机酸及细菌解析

张雅琳，李婧,2，刘廷锐，朱文优*，许慧

(1.宜宾学院固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000; 2.成都大学 食品与生物工程学院，成都 610106)

食醋是生活中必不可少的调味品，赋予食物鲜味、酸味、咸味等滋味。此外，食醋还具有抗氧化、降血糖和抑菌等效果。四川麸醋生产工艺常采用生麦麸为原材料，药醋曲作为发酵剂，主要通过糖化、酒化和醋化3个工艺发酵而成。

食醋的酸味是其最具代表性的感官特征，研究发现有机酸是食醋酸味的重要来源，能直接影响食醋的感官和品质。有机酸主要分为挥发性有机酸和难挥发性有机酸，其中挥发性有机酸主要以乙酸为主体，而难挥发性有机酸能调和乙酸的刺激气味，用于调和食醋的口感[1]。研究学者李俊雯[2]对镇江香醋、山西老陈醋、福建红曲老陈醋和四川保宁醋中的有机酸种类和分布进行了研究，确定了有机酸对食醋呈味的贡献，结果表明，乙酸对醋的酸涩味贡献最大，丙酸次之；杜宏福[3]研究了山西老陈醋发酵过程中有机酸的产生规律，发现在醋醅发酵过程中，食醋中的主要有机酸为乙酸和乳酸，其中乙酸的含量随着发酵时间的增加而增长；纪凤娣等[4]采用离子色谱法分析镇江香醋中乳酸、乙酸等有机酸的含量，研究发现食用醋中有机酸主要来源于乳酸杆菌属(Lactobacillusspp.)产生的乳酸和醋酸杆菌属(Acetobacterspp.)产生的乙酸[5-6]。目前对食醋的研究多集中于对挥发性有机酸香气成分的分析以及对有机酸含量的定量分析，但是对食醋中有机酸组成以及细菌与有机酸生成相关性的研究较少。本研究对四川麸醋醋醅发酵过程中产生的有机酸和主要产酸菌属变化进行研究，以期为提高四川麸醋风味、优化菌群提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 原材料

四川麸醋醋醅：四川宜宾思坡醋厂。

1.2 仪器与设备

Agilent 1220 Infinity LC高效液相色谱仪、GC6890N-MSD5975气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；78HW-1恒温磁力搅拌器 杭州仪表电机有限公司；AE224C电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；Target-H色谱柱 美国MS科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的采集

采集发酵第1，5，9，13，17，21天的醋醅，分别在醋醅的上层、中层、下层和四周进行取样，混合均匀后作为一个样品，放置于无菌密封的采样袋中，置于-80 ℃冰箱中保藏待测。

1.3.2 总酸的测定

参考GB/T 12456-2021[7]中的方法测定醋醅中的总酸含量。

1.3.3 挥发性酸的测定

参照刘廷锐[8]的方法测定醋醅中挥发性酸。

1.3.4 有机酸的测定

取50 g醋醅样品置于150 mL超纯水中浸泡3 h，过滤后取滤液10 mL移至50 mL容量瓶中，加入1 mL(106 g/L)亚铁氰化钾和1 mL(300 g/L)硫酸锌去除滤液中的蛋白质，定容，混匀，静置30 min，取上清液，采用0.22 μm过滤后进行测定。

1.3.5 挥发性风味物质的测定

取3 g醋醅样品放入15 mL样品瓶中，再加入1.5 g氯化钠和6 mL超纯水，盖好样品盖后依次进行预热、恒温和上机等步骤。

1.3.6 醋醅样品中细菌DNA提取和测序

将醋醅样品送至上海美吉公司进行细菌DNA提取和MiSeq测序，对细菌的16S rDNA的V3～V4区(338F-806R)扩增，引物序列分别是338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。

2 结果与分析

2.1 四川麸醋发酵过程中总酸变化

酸是食醋具有代表性的感官特征，总酸包括挥发性酸和非挥发性酸，非挥发性酸中以乳酸为主，主要是调和食醋的刺激性气味。四川麸醋发酵过程中总酸的变化见图1。

图1 醋醅中总酸含量随发酵时间增加的变化

由图1可知，四川麸醋的总酸含量随着发酵时间的增加而增加，在发酵第1天，醋醅中总酸含量为1.33 g/100 g，在发酵第21天，醋醅中总酸含量为5.08 g/100 g。在醋醅发酵过程中，发酵环境中的乳酸菌和醋酸菌等产酸菌利用碳水化合物，产生酸性物质，如乳酸和醋酸等有机酸，导致醋醅总酸上升。在发酵前5 d，醋醅的总酸含量快速上升，可能是由于发酵初期，醋醅环境中乳酸菌产酸导致醋醅中总酸上升。在发酵第5天～第9天，醋醅中的总酸含量增长缓慢，可能是环境中乙醇抑制了醋醅中产酸菌的增长，所以总酸的增长减缓。在发酵第9天后，醋醅中总酸上升，此时是醋酸发酵过程，乙醇在醋酸菌作用下转化为乙酸。

2.2 四川麸醋发酵过程中挥发性酸变化

乙酸是食醋中主要的挥发性酸，赋予食醋独特的风味物质。四川麸醋发酵过程中挥发性酸含量的变化见图2。

图2 醋醅中挥发性酸含量随发酵时间增加的变化

由图2可知，四川麸醋的挥发性酸含量随着发酵时间的增加而增加，在发酵第1天，醋醅中挥发性酸含量为0.05 g/100 g，在发酵第21天，醋醅中挥发性酸含量为2.71 g/100 g。在发酵第1天～第9天，醋醅中挥发性酸含量增长缓慢，在发酵第9天，醋醅中挥发性酸含量为0.54 g/100 g，在发酵第9天后，醋醅中挥发性酸含量随着发酵时间的增加而快速增长。醋醅发酵过程中，经过“糖化、酒化、醋化”3个过程，醋化过程是乙酸生成的主要阶段。

2.3 四川麸醋发酵过程中有机酸分析

四川麸醋醋醅中乳酸和乙酸在有机酸中的含量超过80%，挥发性有机酸中主要是乙酸，非挥发性有机酸中主要是乳酸，研究表明乙酸和乳酸的比值对食醋的品质和感官有重要的影响，可见通过乙酸和乳酸的比值可比较不同时期食醋之间的差异[9]。四川麸醋醋醅中乙酸和乳酸的比值随着发酵时间增加的变化见图3。

图3 醋醅中有机酸含量随发酵时间增加的变化

由图3可知，随着发酵时间的增加，乙酸和乳酸的比值先减小后增大，在发酵第5天，乙酸和乳酸的比值达到最小值1.05。在发酵第17天，乙酸和乳酸的比值减小。在发酵第21天，乙酸和乳酸的比值达到最大值2.07。在麸醋陈酿期间，乙酸和乳酸的比值在2.00～3.02之间，此时的食醋具有柔和的清香[10]。

2.4 四川麸醋发酵过程中细菌的变化

四川麸醋中乳酸杆菌属(Lactobacillusspp.)和醋酸杆菌属(Acetobacterspp.)的占比随着发酵时间增加的变化见图4。

图4 醋醅中细菌占比随发酵时间增加的变化

由图4可知，在发酵第1天，醋醅中乳酸杆菌属和醋酸杆菌属的占比分别为49.01%和9.86%。在发酵初期，醋醅中主要以乳酸杆菌属为优势菌属，在发酵第5天，乳酸杆菌属的占比达到最大值65.86%。随着发酵时间的增加，醋醅中乳酸杆菌属的占比开始下降，这是因为在酒化过程中，醋醅环境中会生成大量的乙醇，抑制了醋醅中乳酸杆菌属的增长。在发酵第21天，发酵环境中乳酸杆菌属的占比为20.71%。而醋酸杆菌属的占比随着发酵时间的增加而逐渐上升。在发酵第13天，醋酸杆菌属成为优势菌属，在发酵环境中占比为41.53%。在发酵第21天，醋醅环境中醋酸杆菌属的占比为65.63%。乳酸杆菌属中主要为耐酸乳杆菌(Lactobacillusacetotolerans)和食淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)，其中耐酸乳杆菌对乙醇有一定的耐受性，并且具有较强的产乳酸和乙酸的能力[11-12]；而食淀粉乳菌杆是人类肠道中常见的益生菌，能产生细菌素和有机酸等物质来抑制病原菌的生长[13]。醋酸杆菌属中主要为巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianus)，巴氏醋杆菌具有强耐乙醇特性，并且能将醋醅中的乙醇转化为乳酸和乙酸等物质[14]。

2.5 四川麸醋中风味物质分析

对麸醋醋醅中的风味物质进行分析，结果见表1。

表1 醋醅中风味物质

由表1可知，风味物质主要分为5类，其中酯类物质有9种，主要有乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、2-羟基丙酸乙酯，研究发现食醋的香味物质主要来源于酯类，其中麸醋中含量最高的乙酸异戊酯具有水果的香气，而乙酸苯乙酯具有玫瑰花和蜂蜜的香甜[15-16]。酸类物质主要有4种，其中主要是乙酸，含量达到43.56 mg/100 g，其次为异戊酸，含量为6.07 mg/100 g。醇类物质检测出6种，苯乙醇含量最高，为10.58 mg/100 g，食醋中的醇类物质多为酵母菌发酵转化而生成，因为苯乙醇具有玫瑰花的香甜，能赋予食醋香味和甜味[17]。检测出羰基类物质4种，乙偶姻的含量为2.75 mg/100 g，研究发现，乙偶姻有利于微生物的繁殖，能够减少醋醅环境中乳酸等物质，稳定发酵环境的pH；此外，乙偶姻能赋予食醋奶香味[18]。

3 总结

四川麸醋是四川具有特色的调味品，研究四川麸醋醋醅发酵过程中的总酸、挥发性酸、有机酸、微生物和风味物质的变化。结果发现，四川麸醋醋醅总酸含量和挥发性酸含量随着发酵时间的增加而增加，在发酵第21天时分别为5.08 mg/100 g和2.71 mg/100 g。乙酸和乳酸的比值随着发酵时间的增加先减小后增大，在发酵第5天时乙酸和乳酸的比值达到最低值1.05。醋醅中乳酸杆菌属随着发酵时间的增加先上升后下降，发酵第5天时乳酸杆菌属的占比达到最大值65.86%；醋酸杆菌属随着时间的增加而增加，在发酵第21天时醋酸杆菌属的占比达到最大值65.63%，醋醅中共检测出风味物质24种。