优化提取潼川豆豉中抗氧化成分及其抗氧化活性研究

池玉闽，贾利蓉，邓莎，王书语，向燕，何培君，董怡

(四川大学 轻工科学与工程学院，成都 610065)

豆豉是一种以黑豆或黄豆为原料发酵制成的风味调味品，是中国四大传统发酵豆制品之一[1]。潼川豆豉是源于四川省绵阳市三台县的一种特色豆豉，距今已有300余年的历史，在2008年被列入我国国家级非物质文化遗产名录[2]。潼川豆豉通常以黑豆为原料，毛霉为主要发酵菌种，经过长时间低温的传统自然发酵制成，具有颗粒柔软松散、色泽黑润油亮、气味清香、滋味鲜美回甜等特点[3]。

多项研究表明豆豉具有抗氧化、降血压、保护心脑血管、预防癌症等功能[4]。大豆经过发酵后不仅保留了原料中大多数的营养成分，同时生成了一些具有生物活性的成分，增强了豆豉的抗氧化能力及其他功能特性[5]。豆豉中的抗氧化物质主要有大豆异黄酮、植物多酚、大豆多肽、类黑精等[6]。近年来，心脑血管疾病和动脉硬化等慢性疾病的发生率逐年增加，可能是由自由基引起的机体氧化损伤，而在日常饮食中增加天然抗氧化物质的摄入是一种很好的抵御自由基损伤的方式[7]。

目前主要提取的抗氧化活性成分方法有超声波辅助、加压辅助、酶法辅助等[8]。超声波处理的原理是利用超声空化效应，伴随热效应和机械作用，可以破坏细胞结构，能够很好地加快混合效率、缩短提取时间[9]。本文利用响应面法优化超声辅助乙醇提取潼川豆豉中的抗氧化活性成分，同时评估了潼川豆豉提取物的综合抗氧化能力，再进一步利用LC-MS技术对其物质基础进行了分析，为潼川豆豉的深度开发利用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

潼川豆豉：市售。

1.2 试剂

无水碳酸钠：分析纯，成都金山化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、染料木素、没食子酸：生物试剂，上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、福林酚、铁氰化钾、三氯乙酸、过硫酸钾：均为分析纯，成都市科龙化工试剂厂；荧光素钠、水溶性维生素E(Trolox)、2,2′-偶氮(2-甲基丙基眯)二盐酸盐(AAPH)：生物试剂，西格玛奥德里奇贸易有限公司；2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS+·)：生物试剂，上海麦克林生化科技有限公司。

1.3 仪器

SCIENTZ-10N冷冻干燥机、SCIENTZ-IID超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；1736R高速冷冻离心机 LaboGene公司；Synergy H1多功能微孔板检测仪 BioTek Instruments Inc.；400A多功能粉碎机 永康市红太阳机电有限公司；DWKW-4电子恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司；Q Exactive Plus质谱仪、Ultimate 3000 HPLC系统 美国赛默飞世尔科技公司。

1.4 试验方法

1.4.1 豆豉提取物的制备

将豆豉样品进行冷冻干燥后，用研磨机粉碎成粉末状，过80目筛，冷藏备用。称取1.00 g豆豉粉末于试管中，分别以不同液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1，mL/g)、乙醇浓度(0%、20%、40%、60%、80%、100%)、超声时间(2.5，5，7.5，10，12.5，15 min)、超声功率(100，200，300，400，500，600 W)进行超声波辅助提取优化。超声波细胞粉碎机每运行2 s后暂停2 s，以保持温度稳定，全程提取液温度不超过40 ℃。提取完成后将提取液以4000 r/min离心10 min，取上清液备用。

1.4.2 异黄酮含量的测定[10]

以染料木素为标准品，配制浓度依次为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL的染料木素乙醇溶液，取100 μL的标准品溶液或豆豉提取液于试管中，加入50 μL无水乙醇和350 μL蒸馏水，振荡均匀后加入96孔板，测定其在260 nm下的吸光度值。同时以无水乙醇作空白对照。以吸光度值为纵坐标，染料木素浓度为横坐标，得到异黄酮含量标准曲线方程为y=6.3276x+0.0223，R2=0.9986。

1.4.3 总酚含量的测定[11]

以没食子酸为标准品，配制浓度依次为0.02，0.05，0.10，0.25，0.50，1.00 mmol/L的没食子酸溶液，取标准品溶液或豆豉提取液100 μL，加入福林酚试剂50 μL后振荡均匀，再加入15%碳酸钠溶液150 μL和蒸馏水700 μL，于37 ℃水浴中反应2 h。水浴结束后立即拿出，用流水降温至室温，并测定其在760 nm下的吸光度。以蒸馏水作空白对照，以吸光度值为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标，得到总酚含量标准曲线方程为y=0.9287x+0.0742，R2=0.999。

1.4.4 DPPH·清除能力的测定[12]

以T rolox为标准品，配制浓度依次为2.5，5，7.5，10，12.5，15，25 μg/mL 的Trolox乙醇溶液，将0.2 mL的标准品溶液或豆豉提取液与等体积的0.2 mmol/L DPPH·乙醇溶液混合均匀后避光反应30 min，之后立即在517 nm下测定吸光度，以无水乙醇作空白对照。DPPH·清除率按式(1)计算，以Trolox浓度为横坐标，清除率为纵坐标，得到DPPH·清除能力的标准曲线，方程为y=0.0316x-0.0038，R2=0.9965。样品的清除率代入标准方程得到样品DPPH·清除能力的Trolox当量。

(1)

式中：Ai为试验组吸光度，A0为空白组吸光度，Aj为对照组吸光度。

1.4.5 响应面优化试验

通过对比单因素试验结果，筛选出合理的参数范围，以乙醇浓度(A)、液料比(B)、超声时间(C)、超声功率(D)为自变量，以异黄酮提取量(Y1)、总酚提取量(Y2)和DPPH·清除能力(Y3)为评价指标，使用Box-Behnken进行响应面试验设计(见表1)，并且运用Design Expert 8.0.6软件分析得到优化后的潼川豆豉中抗氧化活性成分提取工艺条件。

表1 响应面试验水平因素

1.4.6 抗氧化活性评价

1.4.6.1 DPPH·清除能力

方法同1.4.4。

1.4.6.2 ABTS+清除能力[13]

以无水乙醇作空白对照，测定豆豉提取液对ABTS+·的清除能力。ABTS+·清除率按式(2)计算，以ABTS+·清除率为纵坐标，Trolox浓度为横坐标，得到ABTS+·清除能力的标准曲线，方程为y=0.0076x+0.001，R2=0.9975。最终样品的清除率代入到标准方程中得到样品ABTS+·清除能力的Trolox当量。

(2)

式中：Ai为试验组吸光度，A0为空白组吸光度，Aj为对照组吸光度。

1.4.6.3 氧自由基吸收能力[14]

以无水乙醇作空白对照，测定豆豉提取液的氧自由基吸收能力(ORAC值)。以Net AUC为纵坐标，Trolox浓度为横坐标，得到氧自由基吸收能力的标准曲线，方程为y=0.802x+27.758，R2=0.9961。最终样品的ORAC值以Trolox当量表示。

1.4.6.4 还原力[15]

以Trolox为标准品，设置2.5，5，10，15，25，50 μg/mL的浓度梯度，将标准品溶液或豆豉提取液、磷酸缓冲液(0.2 mol/L，pH 6.6)和1%铁氰化钾溶液各取1 mL混合均匀后在50 ℃下水浴20 min。待混合液冷却至室温后，加入0.5 mL 10%三氯乙酸混合均匀。离心(6000 r/min，8 min)后取1 mL上清液，加入1 mL去离子水和0.1 mL浓度为0.1%的氯化铁溶液，振荡均匀后于700 nm下测定吸光度。以无水乙醇作空白对照。以吸光度为纵坐标，Trolox浓度为横坐标，得到还原力的标准曲线，方程为y=0.0016x+0.0493，R2=0.9957。最终样品的还原力以Trolox当量表示。

1.4.7 LC-MS分析

样品用甲醇稀释10倍，高速离心10 min，取上清液分析，进样量5 μL。

LC条件：Hypersil GOLD C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)，柱烘箱温度30 ℃。流动相A为0.1% 甲酸(FA)，B为含0.1% FA的乙腈。流速为0.300 mL/min，洗脱程序为0～3 min，B=5.0%；3～12 min，B=5.0%～95.0%；3～15 min，B=95.0%；15～15.01 min，B=95.0%～5.0%；15.01～18 min，B=5.0%。

MS条件：正、负离子模式，扫描范围：50～1500 Da。

1.5 数据处理

所有试验均进行3次平行操作，最终结果以算数平均值计算。数据结果采用Origin 2019 软件进行绘图和Design Expert 8.0.6软件进行响应面设计与统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

乙醇浓度对抗氧化活性成分提取效果的影响与豆豉提取物中活性成分的极性有关[16]，由图1中a可知，潼川豆豉提取液中总酚含量在乙醇浓度为0%～60%时较为稳定，在乙醇浓度达到80%后开始大幅下降；异黄酮含量在乙醇浓度为60%时达到最大值；DPPH·清除能力在乙醇浓度为40%时达到最大。由图1中b可知，随着超声功率的增大，空化作用、机械作用等效果增强，提取效率提高，提取液各项指标均逐渐增加。由图1中c可知，随着超声时间的增加，提取液中异黄酮和总酚含量先逐渐增加，在10 min处达到最高，之后随时间的延长提取量下降，DPPH·清除能力也在10 min后开始降低。可能是由于长时间的超声波处理破坏了部分生物活性成分，导致提取液的抗氧化能力下降[17]。由图1中d可知，随着液料比的升高，豆豉样品各项提取指标均逐渐上升，在液料比为25∶1 (mL/g)时达到最高，随后逐渐下降。

图1 不同单因素对抗氧化活性成分提取效果的影响

综合考虑，选取乙醇浓度20%、40%、60%，超声功率400，500，600 W，超声时间7.5，10，12.5 min，液料比20∶1、25∶1、30∶1 (mL/g)进行进一步的响应面优化。

2.2 响应面优化提取工艺

2.2.1 响应面试验结果及方差分析

根据单因素试验结果，使用Box-Behnken软件对潼川豆豉抗氧化活性成分提取率有影响的4个因变量进行试验设计。响应面试验结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果

利用 Design Expert 8.0 软件，对试验结果进行多元回归拟合，得到方程：

总酚得率：Y1=68.33-2.39A+0.091B+0.87C+0.80D-0.46AB-1.72AC+1.32AD-1.85BC+0.53BD+0.59CD-2.13A2-0.74B2-0.96C2-1.58D2。

异黄酮得率：Y2=5.05+0.080A+0.13B+0.045C+0.064D-0.049AB-0.090AC+4.939E-003AD-0.032BC+0.12BD-0.078CD-0.26A2-0.13B2-0.25C2-0.089D2。

DPPH·清除能力：Y3=13.53-0.030A+1.09B-6.189E-003C-0.30D+0.015AB-0.32AC+0.57AD-0.47BC-0.33BD-0.30CD-0.52A2-2.09B2+0.32C2-0.85D2。

由表3可知，总酚得率、异黄酮得率和DPPH·清除能力3项指标的回归模型均极显著(P<0.01)，失拟项均不显著(P>0.05)，可见方程模型与试验拟合较好，对于潼川豆豉中抗氧化成分的提取有较好的预测能力。

表3 回归模型方差分析

在总酚得率模型中，乙醇浓度的影响最大，达到极显著水平(P<0.01)，超声时间和超声功率对其也有显著(P<0.05)的影响；交互影响中，AC与BC的交互作用极显著(P<0.01)，AD的交互作用显著(P<0.05)。4种自变量对于总酚得率的影响从大到小依次为乙醇浓度>超声时间>超声功率>液料比。在Y1模型中，变异系数(C.V.)=1.60%，方程拟合度R2=0.9115，校正系数RAdj2=0.8231，方程拟合度较好，可用于预测试验值。

在异黄酮得率模型中，液料比的影响最大，达到极显著水平(P<0.01)，乙醇浓度对其有显著的影响(P<0.05)；交互影响中，BD的交互作用显著(P<0.05)。4种自变量对于异黄酮得率的影响从大到小依次为液料比>乙醇浓度>超声功率>超声时间。在Y2模型中，变异系数(C.V.)=2.34%，方程拟合度R2=0.8750，校正系数RAdj2=0.7500，方程拟合度较好，可用于预测试验值。

在DPPH·清除能力模型中，液料比的影响最大，其余因素无显著影响(P>0.05)；交互影响中，AD的交互作用显著(P<0.05)。4种自变量对于总酚得率的影响从大到小为液料比>超声功率>乙醇浓度>超声时间。在Y3模型中，变异系数(C.V.)=4.18%，方程拟合度R2=0.9352，校正系数RAdj2=0.8704，方程拟合度较好，可用于预测试验值。

2.2.2 响应面交互作用分析及最优条件验证

利用Box-Behnken分析各自变量之间的交互作用，并用软件拟合出响应面3D图，能较为直观地观察各因素之间的交互作用。交互作用说明各因素之间对于结果的影响并非独立，交互作用越强则一个因素的水平变化依赖于另一个因素的水平变化的程度越强[18]。由响应面立体图和等高线图可以看出，各影响因素间均有一定程度上的交互作用，但强弱不一。由于交互响应面图较多，文中仅展示部分交互作用较强的响应面作为代表。

图2中a、b、c是以总酚提取量为指标的响应面，单因素中乙醇浓度的变化曲面最为陡峭，其次是超声时间和超声功率，而超声时间的坡度相对比较平缓，表明乙醇浓度对总酚得率有更显著的影响，在交互影响中，AC、AD之间的交互作用明显，坡面较为陡峭，对于总酚提取量有较大影响。

由图2中d、e、f是以异黄酮提取量为指标的响应面，BD间的坡面倾斜最大，交互作用最强，其次AC、CD的坡面逐渐平缓，交互作用也变弱。

图2中g、h、i是以DPPH·清除能力为指标的响应面，可知单因素中，液料比对DPPH·清除能力的影响最大，其次是超声功率，而超声时间、乙醇浓度的影响较小。AD、BC、BD之间的交互作用都比较强，对DPPH·清除能力有较大影响。

图2 各因素交互作用的响应面

通过对建立的潼川豆豉中抗氧化成分提取量响应面优化模型进行最大化分析，计算出最优的提取工艺参数为乙醇浓度36.59%、液料比26.39∶1、超声时间10.39 min、超声功率508.95 W。根据此条件预测总酚68.81 mg/g、异黄酮5.07 mg/g、DPPH·清除能力13.59 mg/g。考虑实际操作，将该条件简化为乙醇浓度37%、液料比26∶1、超声时间10.5 min、超声功率509 W。在此条件下，实际得到总酚(68.70±2.40) mg/g、异黄酮(5.11±0.06) mg/g、DPPH·清除能力(13.44±0.18) mg/g，与预测值接近，优化条件参数真实可靠。

2.3 抗氧化活性评价

DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、氧自由基吸收能力和还原力均是常见的评价体外抗氧化活性的指标，其易于操作，效果明显，重现性好[19]，因此本文选用其评价潼川豆豉提取物的抗氧化性。由表4可知，潼川豆豉具有一定的DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、ORAC值和还原力，有着较为全面的抗氧化能力。对比潼川豆豉提取物与常见的抗氧化剂没食子酸，结果显示潼川豆豉提取物在DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、ORAC值和还原力上均显著优于没食子酸(P<0.05)。这可能是由于提取液未经分离纯化，其中含有异黄酮、多酚、游离氨基酸等多种物质，提高了提取物的抗氧化活性，并且不同活性成分对抗氧化能力可能存在着协同增效作用。

表4 潼川豆豉提取物的抗氧化活性评价

2.4 LC-MS分析

为了进一步探明潼川豆豉抗氧化能力的物质基础，对潼川豆豉提取液进行了LC-MS分析，经过一级质谱、二级质谱，得到潼川豆豉提取液中含有氨基酸、有机酸、异黄酮、生物碱、多酚等多种小分子物质，共计50个化合物。总离子流图见图3，具体的化学成分见表5。

图3 LC-MS分析总离子流图

表5 潼川豆豉提取物的主要化学成分

在潼川豆豉提取液中，峰面积较大的主要是一些游离氨基酸及衍生物和短肽类，共有17种。这是由于大豆中蛋白质含量丰富，经过微生物发酵后，逐渐降解成了多种短肽和游离氨基酸。研究表明，天然蛋白酶解物中可能包含一些抗氧化活性低分子混合肽，构成肽的氨基酸种类、数量及氨基酸排列顺序决定着肽的抗氧化能力；多种氨基酸及其衍生物也具有抗氧化活性，如半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、亮氨酸、缬氨酸等[20]。在后续深入研究时，可以通过测定各类物质的含量来确定具体的摩尔占比，推出不同氨基酸及其衍生物、短肽等对豆豉提取液的抗氧化能力的贡献大小。

续 表

续 表

续 表

提取液中其他含量较高的小分子生物活性物质主要是大豆异黄酮、生物碱、大豆皂苷和多酚，以大豆异黄酮为主，包含大豆黄素苷元、染料木素、染料木苷、黄豆黄素、大豆黄素苷5种大豆异黄酮。大豆异黄酮属于杂环酚类，以其强大的抗氧化能力而著称，其抗氧化活性主要取决于结构中羟基的数量和位置[21]。在植物防御系统中，异黄酮作为具有抗氧化活性的抗应激介质，有助于中和由应激条件诱导的活性氧(ROS)[22]。游离的苷元比结合态的糖苷抗氧化能力更强，而在微生物发酵过程中，结合态的糖苷会被酶降解释放出游离的苷元[23]，有研究发现，大豆产品在发酵过程中，其中的结合糖苷和游离苷元的占比在不断改变，从而使得其抗氧化能力提升[24]。

其次，潼川豆豉提取液含量最高的是4种生物碱：甜菜碱、水苏碱、毛果芸香碱和葫芦巴碱，其中峰面积最大的是甜菜碱，在分析出的所有物质中相对含量也较高。生物碱通常有复杂含氮环状结构，展现出较强的生物活性[25]，其中含量最高的甜菜碱已被多项研究证实具有很强的抗氧化作用，可被应用在化肥、饲料中改善动植物的氧化应激，此外，对大鼠多个器官的氧化应激、癌变具有保护作用[26]。提取液中含有两种大豆皂苷，其中含量较高的是大豆皂苷Ⅲ，大豆皂苷是一组广泛分布在植物中的天然糖苷化合物，研究发现大豆皂苷的活性很强，可以很好地调节肝细胞损伤，改善肠道损伤，且有良好的抗氧化能力[27]。其次是一些生物酚，有对香豆酸、2,3-二羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛、4-羟基苯甲醛，其中以4-羟基苯甲醛为主。豆豉多酚中的酚羟基可以与自由基结合，阻断或削弱自由基的氧化反应，起到抗氧化的作用[28]。

潼川豆豉提取液中抗氧化活性物质含量由高到低依次是氨基酸及其衍生物、短肽、大豆异黄酮、生物碱、大豆皂苷和生物酚。由此推测，氨基酸及其衍生物/短肽和大豆异黄酮可能是潼川豆豉中起到抗氧化效果最主要的物质基础，生物碱、大豆皂苷、生物酚也起到了辅助抗氧化的作用。周芳等[29]认为豆豉在发酵后抗氧化活性提升的最主要原因是蛋白质的降解，同时苷元型异黄酮也有显著影响，和本文结果基本吻合。提取液中存在的不饱和磷脂等物质也可能有助于提高提取液的抗氧化能力，并且多种抗氧化物质之间可能会存在着协同增效的作用。在后续深入研究时，可以通过分离纯化每种物质并测定其抗氧化能力来更加精确地推测每种活性物质对潼川豆豉抗氧化能力的贡献。

3 结论

利用超声波辅助提取潼川豆豉中抗氧化成分，将总酚含量、异黄酮含量、DPPH·清除能力作为提取效果的指标，发现乙醇浓度、液料比、超声时间、超声温度都对提取效果有一定的影响。其中，乙醇浓度对总酚得率的影响最大，液料比对异黄酮得率和DPPH·清除能力的影响最大。部分因素之间对提取效果存在着交互作用，其中乙醇浓度与超声时间以及乙醇浓度与超声功率对总酚模型的交互作用达到了显著的水平(P<0.05)。通过响应面法对提取工艺进行优化和分析，建立的总酚得率、异黄酮得率和DPPH·清除能力3项指标的回归方程模型与试验拟合较好，对潼川豆豉中抗氧化成分的提取有较好的预测能力。

评估了潼川豆豉提取物的抗氧化活性，具有良好的DPPH·和ABTS+·的清除能力、氧自由基吸收能力和还原力，且均强于没食子酸。通过LC-MS分析潼川豆豉提取液中的化学成分，共检测出50种物质，发现其中含量最高的是各类游离氨基酸及短肽，共17种，还有大豆异黄酮、生物碱、大豆皂苷、多酚等，这些物质均有一定的抗氧化活性，对潼川豆豉整体的抗氧化能力具有明显的贡献。

综上，潼川豆豉提取物具有良好的抗氧化能力，通过超声辅助响应面优化提取工艺，可得到总酚68.70 mg/g、异黄酮5.11 mg/g、DPPH·清除能力13.44 mg Trolox/g。潼川豆豉的抗氧化活性主要来源于其中的氨基酸/短肽、大豆异黄酮、大豆皂苷、生物碱等小分子生物活性物质。本文研究结果为潼川豆豉中抗氧化物质基础的深入研究及开发利用提供了基础与参考。