EV71外壳蛋白表位肽多克隆抗血清的制备及鉴定

李 晨，张 婷，王志荣，许雪梅

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物物理及结构生物学系，北京 100005)

手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)是一种由肠道病毒引起的传染性疾病。肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是其主要病原体之一。因其具有嗜神经性，严重者可出现神经系统的并发症[1]。目前临床上没有针对EV71的特效药，主要预防措施为接种疫苗。

EV71为直径约24～30 nm正二十面体，内含单股正链RNA，编码一个多聚蛋白, 可水解为3种蛋白(protein，P)，即P1、P2和P3，P2和P3被水解为7个非结构蛋白(2A～2C、3A～3D)，与病毒毒力相关；P1先被水解为3种病毒蛋白(viral protein，VP)，即VP0、VP3和VP1，自主组装形成病毒空心颗粒，随着病毒RNA的进入，VP0进一步被水解为VP2和VP4，此时病毒颗粒的形式为实心颗粒。VP1～VP3位于病毒颗粒的表面，VP4 位于衣壳的内部[2-3]。

EV71基因亚型众多，包括A(BrCr)、B1～B5、C1～C5，其中C4亚型是中国内陆主要流行株[4]。研究表明：核苷酸序列的同源性，同一型内毒株间序列同源性大于92%，不同型间毒株的同源性为78%～83%[5-6]。人群中经常出现交替流行或共同流行，需对现有疫苗进行改进并拓宽保护范围。针对流行株快速制备抗体对于病毒鉴定和疫苗研究至关重要。因此，本研究针对EV71 FY23(C4)的外壳蛋白合成4种表位肽制备抗血清并鉴定结合活性，旨在为EV71的疫苗研究和鉴定提供了检测工具。

1 材料与方法

1.1 材料

MF59佐剂、非洲绿猴肾细胞Vero、EV71 FY23(C4)毒株(本实验室保存)；CpGC274佐剂(上海生工生物工程股份有限公司合成)；SPF级4～6周雌性BALB/c小鼠(北京斯贝福生物技术有限公司)；DMEM培养基(北京兰博利德商贸有限公司)；草地贪夜蛾卵巢细胞Sf9(Invitrogen公司)；昆虫细胞全悬浮培养基粉末(壹生科深圳有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 表位分析与多肽设计：根据EV71 FY23(C4)外壳蛋白VP1～VP4的序列，利用B细胞表位预测软件，即BepiPred、ABCpred、Ellipro、BCPREDS、COBEpro，从亲水性、可塑性、抗原性等多方面进行预测，分析并设计4种表位肽，序列如表1。

表1 表位肽的氨基酸序列

1.2.2 多肽的合成：根据表1进行多肽合成，采用HPLC纯化，纯度为90%。以4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯为交联剂，将表位肽偶联到钥孔虫戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)载体上，获得VP1-KLH、VP2-KLH、VP3-KLH和VP4-KLH多肽，用PBS溶解备用。

1.2.3 小鼠的免疫：将小鼠分为4组，每组5只。初次免疫多肽的剂量为100 μg，强化免疫的剂量为50 μg；采用MF59/CpGC274佐剂皮下注射，免疫6次，间隔两周(day 0、14、28、42、56、70)。最后一次免疫后两周(day 91)尾静脉采血，分离血清，56 ℃加热30 min灭活，-20 ℃放置备用。

1.2.4 表位肽抗血清的鉴定：酶联免疫吸附测定(ELISA)：分别取EV71病毒和EV71 病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)溶液用PBS调整至200 mg/L，加入终浓度为0.01 mol/L DTT和1 mol/L NaOH，76 ℃处理10 min，使其变性。取EV71病毒及变性病毒、EV71 VLP及变性VLP、Vero细胞裂解上清、Sf9细胞裂解上清溶液，分别包被96孔板，100 ng/孔，4 ℃包被过夜。经洗涤、封闭，加入2倍系列稀释的多肽抗血清，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h。加入HRP标记的羊抗小鼠IgG(1∶5 000)，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h。加入OPD底物显色液，100 μL/孔，37 ℃避光显色5 min，加入2 mol/L H2SO4终止液，50 μL/孔，测定A490 nm处吸光度值。阳性判定依据是待测血清与抗原反应孔的A490值大于等于阴性血清与抗原反应孔的A490值的2.1倍。Western blot检测：将空杆状病毒表达样品、Sf9细胞裂解上清、EV71病毒、EV71 VLP进行12%SDS-PAGE后，将胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜，用含5%脱脂奶粉的PBST封闭2 h，加入不同稀释度的多肽抗血清，4 ℃孵育过夜，洗膜5次，加入HRP标记的羊抗小鼠IgG(1∶5 000)，室温孵育2 h，ECL显色。

2 结果

2.1 血清抗体效价的测定

4种表位肽抗血清的效价均为1∶102 400(图1)。

图1 血清抗体的效价

2.2 表位肽抗血清与EV71病毒及变性病毒的结合能力

以EV71病毒和变性病毒为包被抗原，4种抗血清均可与之有效结合。VP2抗血清与变性病毒的结合能力比与病毒的结合能力高(图2B)，VP1抗血清和VP3抗血清与两种抗原的结合能力相差不大(图2A,C)。VP4的抗血清在较低稀释度下与两种抗原的结合能力存在一定差异，但是差异并不大(图2D)。

图2 4种表位肽抗血清与EV71病毒及变性病毒的结合能力

2.3 表位肽抗血清与EV71 VLP及变性VLP的结合能力

以Sf9细胞表达的EV71 VLP和变性VLP为包被抗原，4种抗血清均可与VLP及变性VLP结合。其中，VP2抗血清与变性VLP的结合能力最高(图3B)。VP3和VP4抗血清与两种抗原的结合能力相当(图3C, D)。VP1抗血清在较低稀释度下与变性VLP结合能力较好(图3A)。

图3 4种表位肽抗血清与EV71 VLP和变性VLP的结合能力

2.4 表位肽抗血清与EV71 外壳蛋白分子的结合能力分析

以EV71 VLP和病毒作为蛋白样品，用4种抗血清进行杂交，VP1抗血清可与外壳蛋白中的VP1结合(图4A)；VP2抗血清与EV71 VLP中的VP0结合，与EV71病毒的空心颗粒的VP0及实心颗粒的VP2结合(图4B)；VP3抗血清没有结合活性(图4C)；VP4抗血清与P1蛋白有一定结合活性(图4D)。

A.primary antibody: anti-VP1, 1∶1 000; B.primary antibody: anti-VP2, 1∶1 000; C.primary antibody: anti-VP3, 1∶2 000; D.primary antibody: anti-VP4, 1∶2 000

3 讨论

VP1和VP2抗血清在ELISA和Western blot实验中均有结合活性。VP1和VP2抗血清与变性病毒和变性VLP的结合能力较好，因为在天然病毒颗粒中，两种抗血清对应的表位位置相对隐蔽。病毒变性后蛋白之间的结构被破坏，表位充分暴露，结合能力提高。研究发现[7]EV71病毒颗粒5倍对称轴周围存在一个凹陷区，称为“峡谷”，是EV71与人清道夫受体B类成员2(scavenger receptor class B member 2，SCARB2)结合的重要结构。VP1 GH loop和VP2 EF loop是“峡谷”区域的重要表位[8-9]。本研究合成的VP1和VP2表位肽分别对应VP1 GH loop和VP2 EF loop，实验结果进一步验证了这两段表位在天然病毒颗粒中暴露不充分。

VP1和VP2抗血清特异性好，结合能力强。VP2抗血清可协助鉴别病毒的空心颗粒和实心颗粒。VP1(aa.204-223) 和VP2(aa.133-163)表位为线性表位。有报道[10]针对台湾株EV71 TW/2086/98(C)设计合成多肽，发现VP1-43(VP1aa.206-225) 和VP2-28(VP2aa.136-150)为中和线性表位。本研究同其他研究结果的一致性可说明同一基因型不同毒株之间相对应的序列具有一定保守性。VP2抗血清与EV71 VLP和病毒的结合能力相当，说明其对应的表位比较稳定， 不容易受样品类类型的干扰。研究[10-11]表明VP2不会被甲醛破坏并可长期保存，可利用其作为EV71疫苗的效能替代检测标记物。

VP3和VP4抗血清在ELISA实验中有结合活性，但是在Western blot中没有结合活性。可能是因为表位特异性不强，免疫小鼠后产生别的特异性抗体相对较少，导致ELISA实验非特异性结合增加。VP3表位肽是由VP3的139-148位氨基酸和173-191位氨基酸串联合成。研究证明VP3(aa.176-190) 是一段构象中和表位[12]。VP3抗血清与变性蛋白结合能力差，可说明VP3表位具有构象依赖性。由于VP4的分子量小，抗体对其捕获能力较弱，与VP4蛋白无杂交带。但是VP4抗血清与P1蛋白有一定的结合活性，可能是因为在变性的P1蛋白中VP4的构象利于其与抗血清结合。VP4抗血清对不同形式的蛋白鉴别能力差异大，不适合作为检测抗体。

综上所述，本研究制备的VP1和VP2抗血清为ELISA和Western blot方法提供实验材料。对于不同的流行株，采取软件预测的方式合成多条表位肽，评估其应用价值，为毒株鉴定和疫苗研究提供检测方法。