经典血清分型法与分子分型法对肺炎链球菌血清分型的检测结果比较

柳青 李云慧

肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae,SP)是一种常见致病菌,属于革兰阳性双球菌,对儿童和老年人的损伤最大,可导致儿童和成人发生社区获得性肺炎。我国发病率约是全世界的15%左右,而且6 岁以下儿童因为感染肺炎链球菌后死亡的人数也是最多的［1］。肺炎链球菌已成为重要的全球公共卫生问题,除疫苗外,目前没有公共卫生策略可减少其发病率［2］。肺炎链球菌的外囊多糖可以使体内产生保护性抗体,并用于制备疫苗。对肺炎细菌的血液进行监测,为肺炎细菌疫苗的制备和疾病预防提供重要的科学依据。经典荚膜肿胀法是肺炎链球菌的血清分型方法,虽然其发挥着重要作用,但也有一些局限性,例如低分辨率、复杂的操作步骤和主观判断结果。随着荚膜多糖基因序列(CPS)的出现,分子分类技术以其灵敏度高、快速、准确、分辨率高、质量好等优点逐渐得到广泛应用。本文使用经典的荚膜肿胀方法和多重PCR 方法用于相同标本的血清分型,为建立快速准确的血清分型方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2019 年1 月～2020 年12 月在北部战区总医院住院患者中分离的50 株肺炎链球菌作为研究对象,排除相同患者同一部位重复分离菌株。

1.2 方法 分别采用经典荚膜肿胀法与多重PCR 法进行血清分型检测。

1.2.1 试剂与仪器 哥伦比亚血平板,VITEK compack 型全自动分析系统,棋盘式分型系统(pneumotest kit)试剂盒(丹麦国家血清研究所)0.1 g/dl的亚甲蓝溶液,Leica DM2000 显微镜,QIAamp⑧DNA Mini Kit 核酸提取试剂盒,肺炎链球菌血清型分型引物,Taq DNA 聚合酶,PCR 扩增仪等。

1.2.2 试验操作过程 细菌分离培养按《全国临床检验操作规程》进行,挑取待测菌落在血平板上作奥普托欣(Optochin)试验。经35℃10 ml/dl CO2过夜孵育,若Optochin 纸片周围抑菌环直径＞14 mm 判为Optochin试验敏感,可以确定该检测菌株为肺炎链球菌。若抑菌环直径为9～13 mm 时应参照胆汁溶菌试验,其他草绿色链球菌的抑菌圈直径为＜8 mm。不敏感的就可以确诊为非肺炎链球菌。所有菌株经VITEK2 compack 型全自动微生物分析系统加以鉴定。选取标准菌株美国模式菌种收集中心(ATCC) 49619(已知血清型为19F)作为质控菌株。50 株肺炎链球菌菌株均以湿牛奶冷冻法置于-76℃冰箱保存。试验时将肺炎链球菌冻存管从-76℃冰箱取出至室温,挑取3～5 μl 菌液接种于哥伦比亚血平板上,35℃,5 ml/dl CO2培养18～24 h。

经典荚膜肿胀法：①原理利用：棋盘式分型系统(pneumotest kit)分型［3］的经典荚膜肿胀方法。实验原理是肺炎链球菌特异性抗血清与荚膜抗原结合形成复合物,经染色后镜下可见细菌荚膜显著增大或出现凝集；②操作步骤：挑取肺炎链球菌菌落放入小试管中,制成菌悬液约0.5 麦氏单位溶液；挑取约3 μl 菌悬液放入载玻片上,分别加入3 μl 纵列和横行分型血清池,与菌悬液充分混匀。加入血清池的具体操作顺序从上到下、从左到右(严格按产品说明书操作)；在上述混悬液中加入一接种环0.1 g/dl 的亚甲蓝溶液,放入载玻片上与抗血清混匀1 min,盖上盖玻片,在显微镜下观察是否有荚膜或凝集出现。

多重PCR 法：①DNA 提取：用QIAamp⑧DNA Mini Kit 核酸提取试剂盒提取细菌DNA,一切操作按照试剂说明书进行；②引物合成：肺炎链球菌血清型分型引物(http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/pcr.htm)上提供的,由上海生工生物工程有限公司合成；③PCR血清分型方案：基于美国目前主要流行血清型的肺炎链球菌PCR 血清分型方案；④PCR 扩增：PCR 反应体系为25 μl：Premix Taq(日本Takara 公司)12.5 μl,引物10 μl,dd H2O 1 μl、DNA 模 板1.5 μl。PCR 扩增条件：94℃ 4 min 预变性,94℃45 s 变性,54℃45 s 退火,72℃ 2 min延伸30个循环,最后72℃2 min作末端延伸。PCR 产物电泳后观察结果。

1.3 观察指标 比较两种方法的血清分型率。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件进行数据统计分析。计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

多重PCR 法血清分型率76.0%高于经典荚膜肿胀法的44.0%,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 两种方法对50 株肺炎链球菌的血清分型率比较［株(%)］

3 讨论

荚膜肿胀试验(quellung 反应) 是由Neufeld 于1902 年命名的,发现肺炎链球菌抗血清可以和同型菌荚膜产生一种肿胀特征。棋盘式分型系统是传统微生物实验室进行肺炎链球菌血清分型的理想方法,但其操作步骤复杂,血清成本昂贵,而且通常取决于操作员的主观性解释结果,需要高专业技能,只能分为群体,细分类型需要单因素抗血清［4］。本研究表明,经典的血清分型方法对类群分类更具意义,但具体结果不明显。这些因素不仅给血清分型技术的研究带来困难,而且限制了血清分型技术的推广。随着PCR 法的不断发展,为了成功克服传统血清分型技术的不足,基于PCR 法的分子分类方法显得特别重要。2011 年,瑞士学者Gervaix 等［5］在第一届感染预防和控制国际会议上,报道了以多重PCR 和微阵技术相结合的新方法来自动检测肺炎链球菌的血清分型。这种方法首次利用多重PCR 对肺炎链球菌溶血素、自溶素以及其他8 个荚膜操纵子基因进行扩增,相应引物被标记和点到微阵列芯片上,在自动分子诊断系统中使用聚焦激光显微镜进行扫描结果并分析,结果显示这种新技术可准确识别出其中包括结合疫苗中出现的13 个血清型等51 个肺炎链球菌血清型。此外,基于PCR 法的分子分类方法可以用于某些直接被血清识别的样本类型,也可以用于对某些传统的血清学布局方法不敏感的样本的检测。本次研究证实,多重PCR 法比经典夹膜肿胀法分型率高,和李建平等［6］研究的结果相同。原因是荚膜肿胀法主要根据不同的多糖荚膜抗原和特异性血清抗原及特异性血清在肺炎的外层而产生较大的影响。肺炎杆菌株经过反复传代,由于自身的溶解酶作用,细菌逐渐溶解,有报道称,普通人工培养基上的荚膜容易丢失,多重PCR 法是由一个典型的引物合成基因簇(CPS)组合提取的DNA 相关荚膜,不受荚膜影响。由于区域、年龄和人口等不同因素的影响,可引起疾病的肺炎链球菌的血清型也不同。根据徐飞等［7］研究结果证实,肺炎链球菌血清型以19F、23F、6B、4、15B 为主。李马超等［8］研究了杭州地区肺炎链球菌最常见的血清型为19F,其次为19A、6A、23F 和15B。潘芬等［9］分析了的48 株肺炎链球菌,以19F、19A、9V、6B、23F 为主。而本次研究发现19F 的比例较高,与刘又宁等［10］的研究结果相似。血清型替代削弱了接种七价肺炎链球菌结合疫苗(PCV7)的益处,并对生存率有选择性压力。随着PCV13 增加19A,其为肺炎链球菌带来了更大的预防益处。然而,PCV 由于其荚膜血清型的改变和昂贵的成本,在许多发展中国家并没有得到广泛的应用。肺炎链球菌的分子分型也存在一些不足,虽然人复合前列腺特异性抗原(CPSA)引物扩增的基因序列高度保守,但由于CPSA 基因的缺失或突变可能导致极少数菌株不能从阳性产物中扩增出来［11］。引物的设计存在一些缺点,首先,以PCR 为基础的分子分型方法鉴定的肺炎链球菌血清型/群有限。肺炎链球菌有90 多种血清型,目前仅发表了40 多种血清型序列,但仍有50 多种血清型。部分引物具有血清型特异性而非血清型特异性,6A、6B、6C、6D 引物阳性扩增结果只能细分到6C、6D,其结果可能是血清型6C、6D；15B、15C 引物阳性扩增结果有可能是15B 或15C；不能细分型的还 有15A、15F、35A、35C、42、7C、7B、40、10F、10C、33C、9V、9A、33F、33A、37。另外,多重PCR法鉴定的结果之间存在交叉反应［12］,如7A 与7F、6A与6B 之间存在相似性。

综上所述,多重PCR 法分子分型技术虽然有一定的局限性,但与经典荚膜肿胀法相比,其具有简单、分辨率高、灵敏度强、准确可靠等优点,可广泛应用于肺炎链球菌的常规检测,成为一种可靠的分型方法。