新型冠状病毒对睾丸功能的影响

夏煜琦 宁金卓 程 帆 李 维 阮 远 余伟民 饶 婷

武汉大学人民医院 1泌尿外科，2麻醉科 湖北 武汉 430060

2019 年12 月暴发的新型冠状病毒肺炎（corona‑virus infective disease 2019，COVID‑19）在世界范围内迅速蔓延，对全球公共卫生安全构成了严重威胁，有效控制疫情显得尤为迫切和关键［1，2］。大量针对2003 年暴发的严重急性呼吸综合征（sever acute respiratory syndrome，SARS）的研究发现，SARS 病毒通过其刺突蛋白受体结合域（RBD）与宿主细胞血管紧张素转换酶2（ACE2）受体的结合感染人体细胞［3］。新型冠状病毒（SARS‑CoV‑2）是一种与SARS 病毒高度同源的冠状病毒，分子模拟显示SARS‑CoV‑2 的 RBD 与 ACE2 受 体 结 合 较 SARS病毒更强，提示在 SARS‑CoV‑2 致病过程中ACE2可能同样发挥重要作用［4］。文献显示，SARS 患者睾丸中存在大量白细胞浸润，提示SARS 病毒可能引起睾丸炎和广泛的生精细胞破坏，进而影响男性生精功能［5］。目前，SARS‑CoV‑2 对睾丸功能的影响尚未阐明。本研究将利用在线数据库检索并分析ACE2 蛋白及RNA 在人类组织器官的分布，回顾性分析 SARS‑CoV‑2 在精液中的检出情况，探讨SARS‑CoV‑2 对睾丸功能的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象纳入2020 年1 月2 日至2020 年3月7 日武汉大学人民医院收治的确诊成年男性COVID‑19 患者112 例，诊断依据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》［6］。排除标准包括：既往疾病可能导致睾丸血睾屏障破坏，包括睾丸炎、睾丸外伤、睾丸扭转、生殖道梗阻、隐睾、精索静脉曲张、睾丸活检后及输精管结扎病史等。本回顾性研究已获得武汉大学人民医院临床伦理委员会批准（批件号：WDRY2020‑K105）。

1.2 数据收集回顾性收集与分析纳入患者病历资料，包括年龄、身高、体质量等；生殖系统疾病病史、家族史、过敏史，吸烟与饮酒；男性生殖系统症状如阴囊不适、肿胀、疼痛情况，及治疗情况、病史中重要症状体征，既往精液检查情况；与COVID‑19发病的关系；喉咽拭子及精液SARS‑CoV‑2 RNA检测结果。根据患者病史分为喉咽拭子核酸阳性组、喉咽拭子核酸转阴组。发病时间定义为出现症状的时间。

1.3 在线数据库检索与分析利用HPA（The Hu‑man Protein Atlas portal）在线公共数据库（http：//www. proteinatlas. org/）［7］检 索 ACE2 蛋 白 及 RNA在人类组织器官的分布情况及睾丸免疫组织化学染色图片。部分HPA 集成数据来源于GTEx（Genotype‑Tissue Expression）工程［8］。

1.4 实时逆转录聚合酶链式反应（RT⁃PCR）运用 RT‑PCR 检 测 喉 咽 拭 子 和 精 液 样 本SARS‑CoV‑2 RNA。所有标本在武汉大学人民医院检验科分析。 喉咽拭子样本来自疑似COVID‑19 患者，精液样本来自有生育需求的CO‑VID‑19 确诊患者。采集后用生理盐水冲洗喉咽拭子样本、稀释精液样本，使用RNA 提取试剂盒（海尔施，宁波，中国）提取总RNA。引物设计针对新型冠状病毒开放阅读框1ab（ORF1ab）和核衣壳蛋白（N）基因区域。序列为：ORF1ab，正向：CCCT‑GTGGGTTTTACACTTAA，反 向 ：ACGATT‑GTGCATCAGCTGA； 荧 光 探 针5′‑FAMCCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTT ATGG‑BHQ1‑3′； N， 正 向 ：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT， 反 向 ：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；荧光探针5′‑FAMTTGCTGCTGCTTGACAGATTTAM ‑RA‑3′。RT‑PCR 检测使用 SARS‑CoV‑2 核酸检测试剂盒（圣湘生物，长沙，中国），30 μL 反应体系包含 4 μL 酶及 26 μL RNA 模板、引物和反应缓冲液。RT‑PCR 在 50 ℃条件下进行 30 min 逆转录，95 ℃条件下进行1 min 预变性，随后45 个循环：95 ℃ 15 s 变性，60 ℃ 30 s 退火、延伸及荧光采集。Ct 参考值≤40 判定为阳性结果，Ct 参考值>40 为阴性结果。

1.5 统计学分析分类变量用频率和百分比来描述，连续变量用中位数（最大值~最小值范围）来描述。所有统计分析均使用SPSS 19.0 版本软件进行，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GTEx 及HPA 在线数据库分析结果分子模拟提示 SARS‑CoV‑2 可能通过 ACE2 受体感染宿主细胞。为进一步研究SARS‑CoV‑2 的潜在靶点，本研究利用在线公共数据库检索ACE2 蛋白及RNA在人类组织器官的分布情况。GTEx 数据库数据提示在小肠及睾丸组织ACE2 mRNA 水平显著高于人体其他组织器官（图1A）。HPA 数据库数据提示ACE2 蛋白在睾丸组织高表达（图1B）。此外，HPA免疫组织化学染色图片数据库显示ACE2 蛋白在睾丸组织内高表达，且主要表达于生精细胞（图1C）。上述结果提示SARS‑CoV‑2 感染可能导致潜在睾丸损伤。

图1 GTEx 及HPA 数据库检索ACE2 在人类组织器官的分布情况

2.2 研究对象的一般情况本回顾性研究共纳入确诊成年男性 COVID‑19 患 者 112 例 ，年 龄 55.5（23~83）岁。COVID‑19 轻症患者40 例（35.7%），重症患者72 例（64.3%）。在年龄分布方面，重症患者年龄中位数高于轻症患者，86%的重症患者年龄超过40 岁，90%的轻症患者在70 岁以内（表1）。

2.3 研究对象生殖系统情况患者生殖系统症状及体征均有病历记录。112 例男性COVID‑19 患者中，共有3 例（2.7%）患者出现1~3 d 睾丸坠胀，而其余患者均未出现上述男性生殖系统异常症状及体征。值得注意的是，3 例出现睾丸坠胀的患者均为重症COVID‑19，占重症患者4.2%（表1）。

表1 COVID⁃19 患者临床特征

本研究共纳入17 例有生育需求的男性患者，分析其精液 SARS‑CoV‑2 RNA。患者年龄 35（23~83）岁，从COVID‑19 发病至精液检测间隔时间27（12~64）d。行精液检测时，9 例（52.9%）喉咽拭子SARS‑CoV‑2 RNA 仍呈阳性，8 例（47.1%）喉咽拭子 SARS‑CoV‑2 RNA 呈阴性。两组中，17 例患者均未出现上述生殖系统异常症状及体征，精液SARS‑CoV‑2 RNA 检测均为阴性（表 2）。17 例患者中，9 例曾诊断为重症COVID‑19，行精液检测时已转为轻症COVID‑19。

表2 精液SARS⁃CoV⁃2 RNA 检测患者临床特征

3 讨论

SARS‑CoV‑2 与 SARS 病毒高度同源 ，其 中SARS 病毒能通过其刺突蛋白受体结合域（RBD）与宿 主 细 胞 ACE2 受 体 的 结 合 感 染 人 体 细 胞［3，4］。ACE2 作为一类膜蛋白，能直接参与肾素‑血管紧张素系统，将血管收缩素Ⅱ水解为血管紧张素（1~7）［9］。据报道，SARS‑CoV‑2 与 SARS 病毒均具有RBD 结构，能通过ACE2 受体进入宿主细胞进行增殖及传播，提示 ACE2 在 SARS‑CoV‑2 入侵人体并导致感染的过程中发挥重要作用［4，10］。本研究基于数据库探究ACE2 在人类组织器官的分布情况，发现ACE2 在睾丸组织高表达，且主要位于生精细胞，提示SARS‑CoV‑2 感染可能会导致睾丸损伤。

除了典型的呼吸道症状（发热、咳嗽）外，COVID‑19 患者可能出现某些非特异性症状，如腹泻、头痛、乏力等，甚至有少数患者没有症状［11］。本研究中我们纳入轻症及重症COVID‑19 男性患者共112 名，共有 3 例（2.7%）患者出现 1~3 d 睾丸坠胀，其余患者均未出现男性生殖系统异常症状及体征。提示短期内SARS‑CoV‑2 并未引发显著男性生殖系统异常症状及体征。因此，检测精液中的SARS‑CoV‑2 RNA 可能对了解 SARS‑CoV‑2 对睾丸功能的影响更有价值。

SARS‑CoV‑2 的传播途径包括呼吸飞沫传播和接触传播，也可发生气溶胶传播。患者粪便中也曾检出 SARS‑CoV‑2［12］，因此，SARS‑CoV‑2 的性传播可能性也值得探讨。 本研究纳入的17 例COVID‑19 患 者 精 液 中 均 未 检 出 SARS‑CoV‑2 RNA，其中包括9 例喉咽拭子核酸阳性患者和8 例阴性患者。结果提示SARS‑CoV‑2 RNA 并不存在于COVID‑19 患者精液中，这与SARS 患者精液检测结果一致［13］。对于此研究结果我们提出以下几种解释：①血睾屏障作为位于生精小管与间质毛细血管间的结构，可发挥免疫屏障作用，阻止有害病原微生物干扰生精过程，维持睾丸内微环境［14，15］；已有研究通过检测羊水和脐带血中的SARS‑CoV‑2来评估宫内垂直传播，发现SARS‑CoV‑2 无法通过胎盘屏障导致胎儿宫内感染［16］；②睾丸间质细胞及巨噬细胞具有较强的抗病毒能力，能产生干扰素α及干扰素 γ 抵抗病毒，增强免疫调节生精功能［17］；有研究表明在仙台病毒刺激下，睾丸间质细胞及巨噬细胞能分泌多种抗病毒蛋白酶［18］，提示睾丸组织内除了血睾屏障外，还存在一系列抗病毒的免疫防御系统；③考虑到SARS‑CoV‑2 可能导致的潜在睾丸损伤，目前的观察随访还存在一定局限，需进一步探讨。

对于有生育需求的男性COVID‑19 患者，生精功能的复查和长期随访具有重要意义。彩色多普勒超声和常规精液分析是常用的影像学方法和男性生育力检测手段，适用于出现阴囊不适、睾丸肿胀疼痛的男性COVID‑19 患者。研究表明，睾酮及黄体生成素与精子数量、精子活力密切相关［19］，性激素检查可评估性腺内分泌功能，适用于精液分析结果异常的COVID‑19 患者。病毒性睾丸炎能导致睾丸间质细胞损伤，降低睾酮水平并升高促性腺激素水平，导致继发性性腺功能减低［20］。COVID‑19不育患者或精液分析结果异常患者应进行精子核DNA 碎片、精子顶体功能等检测，以评估精子异常的潜在原因。

本研究尚有不足之处，首先，研究结果受限于小样本及回顾性的研究方法，可能出现假阴性结果。其次，缺乏精液分析、生殖激素检查等数据。因此，后续研究中需要扩大样本量，延长随访时间，完善精液分析、生殖激素及精子功能检查。同时，注重对比COVID‑19 患病前后上述指标的变化，以全面评估SARS‑CoV‑2 对睾丸功能的影响。

综上所述，生物信息学分析提示SARS‑CoV‑2对睾丸功能有潜在损伤，但目前并无证据显示COVID‑19 患者出现疾病相关的男性生殖系统异常症状与体征，也未在COVID‑19 患者精液中检出SARS‑CoV‑2 RNA。一线医护人员应密切关注有生育需求的COVID‑19 患者的生精功能。不仅要注意病程中男性生殖系统局部症状与体征的变化，而且需要对男性生育功能进行长期随访。