不同梗死时间脑卒中大鼠腓肠肌超声弹性成像特征与其病理学特征的相关性

李雪宜 吴 猛 徐 群 田 峻

武汉大学中南医院 1康复医学科，2超声影像科 湖北 武汉 430071

脑卒中是目前全球范围内导致长期残疾的主要原因［1］。对卒中患者而言，软组织适应性改变导致的肌肉挛缩，是影响运动功能恢复的重要因素。脑卒中后瘫痪侧骨骼肌肉的继发性改变包括但不限于肌纤维短缩、肌间结缔组织及脂肪组织增多等［2］。

剪切波弹性成像（shear wave elastography，SWE）是一种定量超声技术，通过估算剪切波在肌肉中传播的速度，反映肌肉黏弹性的生物力学特性［3］。临床研究中，SWE 测量卒中后肌肉的剪切波速度（shear wave velocity，SWV）或 Young′s（杨氏）模量等来表示肌肉硬度。大多数研究肯定了其在脑卒中后评估瘫痪、痉挛肌肉的潜在辅助应用价值［4］。

SWE 评估卒中后肌肉的硬度的影响因素目前仍处于探索阶段。已发表的研究指出，不同的肌肉位点［5］、相邻关节的角度［5］、肌肉的发力状态［6，7］均可能对卒中患者测量的肌肉硬度产生影响。部分研究显示，肌肉弹性的改变与其结构成分的改变可能存在一定的相关性。脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）大鼠早期双下肢腓肠肌的Young′s 模量的增大与其GM 的肌纤维构成发生改变可能相关［8］。钝挫伤大鼠早期肌肉炎症水肿，肌纤维断裂，肌肉弹性下降，后期弹性增高时观察到肌纤维修复［9］。卒中模型肌肉硬度的改变与组织结构成分的适应性改变之间的关系也有待进一步探究。临床发现，在长期卒中患者中，卒中后偏瘫侧大腿肌肉间脂肪比例较正常对照组增多［10，11］。因此，本研究的目的是探究不同梗死时间的大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠下肢固定关节角度的腓肠肌硬度的表现，以及腓肠肌的硬度与其肌肉脂肪改变之间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组选取SPF 级体质量为250~280 g 的SD 雄性大鼠（斯贝福生物技术有限公司，北京）26 只，随机分为假手术组6 只、脑梗死1.5 h 组10 只和脑梗死2 h 组10 只。本研究经武汉大学动物伦理审查中心审批（批准号为：2019137）。

1.2 模型制备右侧MCAO 大鼠模型采用改良Zea Longa 线栓法进行制备。将SD 大鼠适应性喂养1 周，术前禁食，采用动物用异氟烷（诱导浓度3%，维持浓度1.5%~2%）对大鼠进行麻醉，随后沿颈正中线切开皮肤1.5~2 cm，钝性分离直至暴露颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA），分别在CCA近心端备线结扎CCA 远心端备线，备线ECA 后结扎，将动脉夹置于CCA 分叉口处，于CCA 两端备线之间剪开小口，插入线栓（广州佳灵生物技术有限公司，型号：大鼠250~280 g），沿颈内动脉进入右侧大脑，直至进栓18 mm 左右稍有阻力时停止进栓，扎紧CCA 远心端备线，简单缝皮处理。实验分为两组，梗死时间分别为1.5 h 和2 h。梗死时间结束后，麻醉下剪开大鼠皮肤缝线，暴露CCA，取出线栓后结扎CCA，加入少量抗生素粉末后，逐层缝合切口。术后大鼠单笼饲养，软食喂养2 周。假手术组的操作与实验组相似，但不进行插线栓步骤。术后24 h进行 Longa 评分，1~3 分者纳入本实验造模组［12］。

1.3 评估方法

1.3.1 一般项目 常规记录大鼠体质量。分别术后 3 d、1 周、2 周、3 周及 1 月对大鼠进行改良神经功能缺损评分（modified neurological severity score，MNSS），用以评价造模效果，分值为0~18 分，分值越大神经功能缺损越严重。分别于术后2 周、3 周和4 周进行背地性测试，用以评估运动功能。背地性测试（negative geotaxis test）［13］，将大鼠头朝地面放置在45 °倾斜的木板上，记录大鼠完成转体180 °所需的时间，重复3 次，结果取均值。

1.3.2 剪切波弹性成像检查 超声检查采用单盲法。剪切波超声弹性成像采用实时型剪切波弹性成像超声诊断仪，L4‑15 线阵探头，频率4~15 MHz。测试流程大致如下：将大鼠GM 部位脱毛备皮后，踝关节固定在90 °位下进行超声检查。在探头处涂抹适量凝胶，将探头长轴轻置于与胫骨长轴平行方向的腓肠肌皮肤上方，将ROI 设置为10 mm×10 mm，深度设置为皮下0.5~1.0 cm。首先实时观察腓肠肌二维灰阶图像与弹性图像，肌肉弹性图像较为稳定后启动弹性成像模式，测量GM 肌腹处 Young′s 模量（kPa），每侧腓肠肌重复测量 3 次，结果取均值。

1.3.3 病理检查 在超声检查结束后进行动物灌注取材，留取双侧下肢GM。将GM 肌腹处肌肉进行冰冻切片后染油红O，观察脑卒中后1 月大鼠GM肌肉内脂肪填充情况。

1.4 数据分析采用SPSS 20.0 软件对所-得实验数据进行分析。定量资料用均数±标准差（）表示。体质量、神经功能缺损评分和运动功能评分，采用两因素重复测量的方差分析（two‑way repeat‑ed measured ANOVA）进行检验；若数据不满足球性检验，则以多变量检验分析结果为准；统计有差异时，采取Bonferroni 法进行两两比较。当满足方差齐性检验时，三组间的剪切波弹性成像检查结果采用单因素方差分析（one‑way ANOVA）；当组间比较具有统计学意义时，进一步采用Bonferroni 法进行两两比较。采用配对t检验比较同组间双侧下肢腓肠肌的剪切波弹性成像结果。采用Pearson 相关分析研究超声弹性成像结果（Young′s 模量）与运动功能、病理结果的相关性。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般项目实验大鼠经MCAO 术后，2 h 组存活 6 只，1.5 h 组存活 7 只，假手术组 6 只，一般项目的结果见表1。

表1 三组实验鼠一般项目评估结果

2.1.1 体质量 不同MCAO 造模梗死时间的大鼠的体质量差别有统计学意义（F=43.27，P<0.01），梗死2 h 的动物体质量低于1.5 h 组和假手术组的动物体质量，但梗死1.5 h 组与假手术组的动物体质量差别无统计学意义；术后恢复的时间也对体质量有影响，MCAO 术后，大鼠的体质量逐渐下降，术后1 周达到最低，随即逐渐增重；梗死时间和恢复时间之间存在交互效应（F=14.11，P<0.01），随恢复时间的延长，三组大鼠体质量改变的幅度不全相同，以梗死2 h 组大鼠的体质量下降幅度最大。

2.1.2 改良神经功能缺损评分 不同MCAO 造模梗死时间大鼠的神经缺损评分的差别具有统计学意义（F=82.37，P<0.01），梗死 2 h 组的神经功能缺损评分最高，其次为1.5 h 组，假手术组几乎没有神经缺损症状。组内比较显示，随着术后恢复时间的延长，大鼠的MNSS 评分逐渐下降（F=85.93，P<0.01）。同时，时间和分组之间存在交互作用（F=2.61，P=0.028），随恢复时间的延长，三组大鼠MNSS 变化的速率存在差异。

2.1.3 背地性测试 背地性测试的组间比较显示，梗死时间不同的三组大鼠的背地性测试时间差别具有统计学意义（F=90.69，P<0.01），梗死 2 h组完成背地性测试所需时间最长，其次为1.5 h 组，假手术组需时最短；组内比较显示，恢复时间对背地性测试时间也有影响（F=45.86，P<0.01），随着恢复时间的增加，背地性测试所需的时间逐渐下降。梗死时间和喂养时间存在交互效应（F=21.61，P<0.01），提示不同梗死时间对背地性测试所需时间的影响会随着时间的变化而变化。

2.2 超声弹性成像结果组间比较得出，三组大鼠的左、右侧GM 的Young′s 模量的差别均具有统计 学 意 义（左 ，F=44.74，P<0.001；右 ，F=183.87，P<0.001）。对右侧（健侧）GM 的 Young′s模量数值进行两两比较，2 h 组、1.5 h 组和假手术组之间均有统计学意义（P均<0.001）。对左侧（偏瘫侧）GM 的 Young′s 模量数值进行两两比较，2 h 梗死组的Young′s 模量均大于1.5 h 组和假手术组（P<0.001），1.5 h 梗死组与假手术组之间差别没有统计学差异（P=0.242）。

组内比较（同组内大鼠健患侧进行对比）结果显示，梗死2 h 组和梗死1.5 h 组大鼠左右侧GM 的Young′s 模 量 差 别 均 有 统 计 学 意 义（2 h 组 ，t=-12.72，P<0.001；1.5 h 组 ，t=-3.62，P=0.01）；假手术组下肢左右侧 GM 的 Young′s 模量差别没有统计学差异（t=-0.95，P=0.382）。

2.3 病理检查油红O 切片结果显示（图1），三组大鼠双侧GM 肌腹切片中细胞核呈蓝色，但极少有红色染色区域。

图1 三组大鼠左侧（偏瘫侧）GM 肌腹横截面油红O 测试结果(ORO×100)

2.4 相关性分析将左右侧GM 的Young′s 模量的差值与术后4 周的运动功能评分进行Pearson 相关分析。结果显示，术后 1 月 GM 的 Young′s 模量的差值与背地性测试结果呈正相关（r=0.641，P=0.003）；GM 的 Young′s 模 量 的 差 值 与 术 后 1 月MNSS 评分呈正相关（r=0.778，P<0.001）。

3 讨论

3.1 一般项目本研究中，MCAO 造模术后大鼠的体质量术后1 周达到最低，随后逐渐增重；假手术组大鼠术后体质量逐渐增加。该研究结果与以往的实验结果一致［14］，造模组大鼠的体质量下降可能与右侧大脑组织受损导致的偏瘫侧运动功能缺损有关，从而影响其抓握、吞咽功能导致的体质量下降，还可能与造模后急性期饮食欠佳有关。进行MCAO 造模的两组大鼠体质量改变的幅度不相同，梗死2 h 组大鼠的体质量下降幅度更大，这可能与2 h 组大鼠存在更严重的神经功能缺损有关。

3.2 MNSSMCAO 造模术后，2 h 组大鼠神经功能的受损相比于1.5 h 组而言更严重。梗死时间的延长导致大脑受损部位的扩大，从而导致神经功能缺损更严重［15］。三组大鼠的MNSS 评分随病程进展逐渐降低，说明随着时间延长，大鼠的神经功能缺损得到改善，神经功能的改善与术后身体恢复有关。

3.3 背地性测试背地性测试可用于反映大鼠的运动功能和协调能力，是一个能反映大脑损伤程度的敏感测试［13］。MCAO 造模术后，2 h 组大鼠完成背地性测试的平均时间比1.5 h 组更长，反映了2 h组的运动功能和协调性更差。随着术后时间的延长，两组造模组大鼠完成背地性测试所需的时间均逐渐缩短，运动功能得到改善。

表2 三组大鼠双侧腓肠肌Young's 模量比较

3.4 超声弹性成像本研究发现，MCAO 造模梗死2 h 组的大鼠在术后1 月时，偏瘫侧GM 的肌肉硬度大于1.5 h 组与假手术组，以及1.5 h 组偏瘫侧GM 的肌肉硬度与假手术组同侧之间没有统计学差异。对此可能的解释为，大鼠缺血损伤的程度和分布对MCAO 闭塞时间高度敏感［15］。梗死的时间越长，对大脑造成的缺血损伤越严重，由此可能导致卒中情况更严重的大鼠偏瘫侧下肢肌肉在恢复早期更早出现肌肉张力增高的改变。

此外，三组健侧下肢GM 肌肉的组间比较结果显示 ，2 h 组 的 Young′s 模量最小 ，假 手 术组居中 ，1.5 h 组最大。结合组间患侧肌肉比较结果分析，结果显示梗死时间不同的大鼠健患两侧下肢肌肉硬度呈现相反的变化趋势。这提示了梗死时间不同的大鼠下肢肌肉在术后1 个月时的肌肉特性改变不完全一致。这可能是由于梗死时间不同导致的大脑损伤区域范围有差异，从而引起的两组大鼠在术后相同时间点下肢肌肉的病理生理状态不完全相同。2 h 组大鼠健侧下肢GM 卒中1 月后硬度相对减少，可能是肌肉在卒中后恢复中一个阶段状态，未来还需要补充样本量更大、观察期更长的多次肌肉硬度测量的实验数据来更好地理解卒中后下肢肌肉特性的改变情况。

1.5 h 组与假手术组健侧肌肉对比结果显示，1.5 h 组的Young′s 模量大于假手术组同侧数据。其中一个可能的解释为，超声弹性成像检查过程中，虽然能够人为地控制测量时大鼠的体位和关节固定的角度，但难以控制大鼠GM 自主收缩程度对肌肉硬度的影响。已发表的研究显示，随着肌肉主动收缩程度的增加，肌肉的弹性成像结果呈非线性增长关系［4］。1.5 h 组大鼠在超声测量健侧 GM 的过程中，由于大鼠处于清醒状态以及健侧下肢肌肉功能更完善，测试大鼠可能由于反抗、过多地主动收缩健侧GM，导致健侧肌肉硬度相对于假手术组更大的结果。而2 h 组大鼠由于下肢整体运动功能较差，GM 主动收缩对其测量结果影响相对较小。

此外，梗死 2 h 组大鼠患侧 GM 肌腹处 Young′s模量大于健侧，提示患侧下肢GM 肌肉硬度大于健侧肌肉。该结果与一项研究卒中6 个月内患者的上肢肌肉硬度改变趋势相符［16］，同时与慢性期卒中患者的肌肉硬度改变趋势也一致［4，5，17，18］，但本实验与慢性期临床试验中解释该趋势的具体相关因素可能并不相同。慢性期临床研究中，卒中后肌肉特性的改变与肌肉成分的改变具有强相关关系，瘫痪侧肌肉结缔组织、脂肪组织的增多［4，10，11］，细胞外基质胶原蛋白含量、形态和基因表达的改变［19］，以及肌联蛋白等细胞内结合蛋白的改变［20］均可能与偏瘫侧肌肉的硬度升高存在相关关系。但是，本实验中的病理实验结果显示，亚急性期的大鼠瘫痪侧与健侧的肌肉在肌肉脂肪含量上并无差异，因此无法得出大鼠亚急性偏瘫侧肌肉硬度的升高可能与脂肪含量改变有关的推论。未来的研究中可能需要更多地考虑脂肪含量改变以外的其他结构改变或神经因素对脑卒中后肌肉硬度的影响。

1.5 h 组组内比较显示，健侧下肢GM 肌肉的Young′s 模量大于偏瘫侧肌肉，提示了梗死时间较短的大鼠健侧下肢肌肉硬度相对增加，这可能是由于测量健侧肌肉硬度时大鼠主动收缩GM 肌肉引起的变化。也可能理解为偏瘫侧相比于健侧硬度呈现相对减少的状态，这可能是由于1.5 h 组大鼠在造模后1 个月时处于软瘫期，偏瘫侧肌肉张力比健侧小。

未来需要样本量更大、观察时间更长的基础实验文章为弹性成像应用在脑卒中大鼠模型研究提供更多的实验证据。

3.5 Young's 模量差值与运动功能的相关性Young′s 模量差值与背地性测试所需时间的相关分析具有统计学意义。结果表明，双侧GM 肌肉硬度差别与运动功能之间存在正相关。双侧肌肉的硬度越不平衡，背地性测试所需时间越长，即大鼠的运动功能越差。此外，GM 的 Young′s 模量差值与大鼠的MNSS 评分同样呈正相关关系，显示双侧肌肉的硬度的差别越大，大鼠的神经缺损程度越严重。

3.6 病理结果与肌肉硬度油红O 测试切片结果显示，三组大鼠双侧下肢GM 中无明显脂肪组织增多。已发表的文献指出，在长期卒中偏瘫侧大腿中，低密度肌肉组织与肌肉面积的比例升高，提示卒中后偏瘫侧大腿肌肉间脂肪增多［10］。而本实验中病理结果中无明显脂肪增多，对此可能的解释为模型仅为MCAO 术后1 月，时间不足导致不能观察到偏瘫侧下肢GM 肌肉中脂肪组织增多，也有可能是下肢肌肉脂肪组织的改变程度不足以被本实验设计的油红O 测试检测得出差异性结果。结合本次油红O 测试实验的结果与三组大鼠的超声弹性成像结果，在脑卒中1 月后，无法得出三组大鼠下肢GM 肌肉硬度的变化与肌肉间脂肪组织的改变之间存在相关关系的结果。

综上所述，MCAO 大鼠造模术中梗死时间越长，对术后1 月内体质量、神经功能缺损评分和运动功能影响越大。卒中1 月后，剪切波弹性成像技术检测到梗死时间不同的卒中模型双侧下肢GM 硬度的差异，表现为梗死时间较长的大鼠瘫痪侧GM 肌肉硬度较大，健侧肌肉硬度相对较小；梗死时间短的大鼠模型偏瘫侧肌肉硬度与假手术组对比改变不明显。MCAO 大鼠 GM 的 Young′s 模量差值与运动功能、神经缺损评分相关；MCAO 术后1 月大鼠GM 肌肉间脂肪组织的改变不明显，与下肢肌肉硬度的改变可能不相关。