溪黄草多酚提取工艺研究

＊宋照风 谭杰安 周子凡 朱峰 赵海全

（佛山科学技术学院 广东 528000）

溪黄草又称风血草、土黄连等，茎叶有细条纹，属唇形科的全草植物[1]。溪黄草常成丛生长在河边、溪边、草地等光照充足的地方，在我国的很多地区都能生长。溪黄草具有凉血退瘀、清热祛湿及退黄等药用价值[2]。目前，对于溪黄草的临床应用，直接水煎服用或提取有效活性成分制成复方中成药治疗疾病[3]。溪黄草含有多糖、多酚、氨基酸、萜类化合物等有机活性物质[4]。多酚作为一种重要的次生代谢产物存在于溪黄草的茎叶中[5]。多酚普遍存在于植物中，它不仅是天然的抗氧化剂，还是重要的功能因子[6]。近年来，关于溪黄草多酚提取工艺[7]的研究报道比较少，为了能够有效提取利用溪黄草中的多酚。超声辅助提取溪黄草多酚相对而言成本较低、易于操作、提取效率高、实用性强。目前多酚检测的方法是福林酚法。本文围绕提取的料液比、溶剂的体积分数、提取温度、超声辅助时间设计正交试验，对溪黄草多酚的提取工艺进行优化。

1.材料与方法

(1)主要原料和仪器

溪黄草购于当地，焦性没食子酸、福林酚等为分析纯。分光光度计为上海美谱达UV-1100等。

(2)溪黄草多酚的提取

将溪黄草粉碎，过60目筛备用；取1.00g溪黄草于烧杯中，按料液比为1:30，加入70%的乙醇；将混合液置于40℃恒温水浴中10min；在超声机中提取30min；过滤，滤液在4000r/min离心10min。取上清液加水至100mL，以测定多酚的提取率；按上述步骤，进行单因素试验及正交试验；根据福林酚法绘制标准曲线，计算多酚的产量及提取率。

(3)福林酚法测定多酚含量

①标准溶液的配制

准确称取0.050g焦性没食子酸，加水定容至50mL，得到焦性没食子酸质量浓度为1mg·mL-1。从上述焦性没食子酸溶液中准确量取0.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL、8.00mL、10.00mL溶液，分别加入到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容，即配置得到质量浓度分别为0.000mg·mL-1、0.020mg·mL-1、0.040mg·mL-1、0.060mg·mL-1、0.080mg·mL-1、0.100 mg·mL-1的没食子酸标准溶液。

②标准曲线测定方法

根据福林酚法，取1.00mL不同浓度标准溶液于试管中，加入1.5mL福林酚溶液，再加入10mL水，避光静置5min，加入6mL碳酸钠缓冲溶液，避光反应1h。测定其吸光度值A，以标准溶液的浓度（mg·mL-1）对吸光度值绘制出标准曲线。

根据实验数据，得到焦性没食子酸标准曲线方程为y=7.9414x+0.0494。该方程的相关系数为R2=0.9988线性回归方程的拟合较好。

(4)数据处理与统计

正交设计试验采用正交软件进行设计和实验数据的处理。

2.结果与分析

(1)乙醇体积分数的影响

取溪黄草1.00g，乙醇料液比为1:30，加入等量的体积分数为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇。将混合液放到40℃恒温水浴中，提取10min后，再转移到40℃超声中，提取30min。取出混合液过滤。滤液高速离心10min，收集上清液，并加水至100mL得到溪黄草多酚待测液。用福林酚法测定不同浓度乙醇对溪黄草多酚提取影响曲线图。

由图1可知，随着乙醇体积分数的增大，溪黄草多酚的提取率升高，当乙醇体积分数达到70%，溪黄草多酚的提取率最大。随着乙醇体积分数继续增加，溪黄草多酚的提取率反而下降，其总体呈现出先增后减的趋势。

图1 乙醇体积分数的影响试验结果分析图

(2)料液比的影响

取溪黄草1.00g，加入乙醇料液比为1:20、1:30、1:40、1:50、1:60，加入体积分数为70%的乙醇。将混合液放到40℃恒温水浴提取10min，再把混合液转移到40℃超声中提取30min。过滤，滤液高速离心10min，收集上清液，并加水至100mL得到溪黄草多酚待测液。用福林酚法测定出不同料液比对溪黄草多酚提取结果的影响曲线图。

从图2可知，随着料液比的减小，溪黄草多酚的提取率升高，在料液比为1:50时，溪黄草多酚的提取率出现最大，而随着料液比的进一步减小，溪黄草多酚的提取率反而开始逐渐下降。因为料液比越小，加入的溶剂越多，不利于溪黄草多酚的提取。

图2 料液比的影响试验结果分析图

(3)超声提取时间的影响

取溪黄草1.00g，乙醇溶剂料液比1:50，加入等量的体积分数为70%的乙醇。将混合液放到40℃水浴锅中提取10min，混合液转移到超声中，提取10min、20min、30min、40min、50min，提取温度为40℃。过滤，滤液高速离心10min，上清液加水至100mL得到溪黄草多酚待测液。用福林酚法测定出不同超声提取时间对溪黄草多酚提取结果的影响曲线图。从图3可知，随着超声提取时间的增大，溪黄草多酚的提取率升高，而且在超声提取时间为30min时，溪黄草多酚的提取率出现最大，而后随着超声辅助提取时间进一步增大，溪黄草多酚的提取率反而逐渐下降。由于超声具有空化效应和机械效应，可能会使溶剂中的多酚发生分解，导致产率降低。

图3 超声提取时间的影响试验结果分析图

(4)提取温度的影响

取溪黄草1.00g，加入乙醇料液比为1:50，加入等量的体积分数均为70%的乙醇溶剂。将溪黄草与乙醇的混合液放到水浴中，水浴温度分别为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，水浴提取10min后，把溶液转移到超声中，辅助提取30min，超声辅助温度分别为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃。取出溪黄草多酚提取液过滤。滤液高速离心10min，收集上清液，并加水至100mL得到溪黄草多酚样品待测液。用福林酚法测定出不同提取温度对溪黄草多酚提取结果的影响曲线图。

从图4中的曲线可以看出，温度越高，溪黄草多酚越不稳定，当超过一定温度时，溪黄草多酚会发生分解使得提取率降低，所以总体呈现出先增后减的趋势。

图4 提取温度的影响结果分析图

(5)正交因素水平试验

根据以上单因素试验的结论，乙醇的体积分数、料液比、超声辅助时间和提取温度这四个单因素都对溪黄草多酚的提取率均存在一定的影响。为了能进一步优化溪黄草多酚的提取工艺，在单因素试验结果的基础上，设计四水平正交试验表，如表1。

表1 正交四水平试验表

(6)正交试验结果分析

表3 正交试验结果方差分析表

根据实验结果可知，不同因素对溪黄草多酚的提取结果影响有差异，其影响程度从极差和偏差平方和分析出来，当极差和偏差平方和越大时，说明它的影响程度越显著。由表2可以看出，各个影响因素的显著性先后顺序为乙醇体积分数＞温度＞超声时间＞料液比。由直观分析可以看出，乙醇体积分数对溪黄草多酚的提取影响更显著。根据方差分析表，四个因素的F比以及F临界值较为接近，说明试验结果存在一定的误差。综上所述，溪黄草多酚的最佳提取工艺乙醇体积分数为75%，料液比为1:50，超声辅助提取时间为30min，提取的温度为35℃。以分析得出的提取最佳工艺条件进行重复性试验三次，结果发现平均提取率与正交试验中的最佳提取条件时的提取率基本一致，说明提取工艺方案具有一定的可行性。

表2 正交试验结果记录表

3.结论

综上所述，随着乙醇体积分数增大，溪黄草多酚的提取率先升后降，说明溶剂的体积分数过大，溶剂浓度越大，越不利于溪黄草多酚的提取；当料液比达到一定值时，溪黄草多酚已经被充分提取，再增加溶剂，反而会降低提取率，而且成本提高；超声提取的时间过长，会破坏溪黄草多酚的结构，使溪黄草多酚的产率降低；而温度在一定范围内，对溪黄草多酚的提取有促进的作用，但温度过高则会造成溪黄草多酚的分解。通过正交实验结果分析，在乙醇体积分数为75%，料液比为1:50，超声辅助提取时间为30min，提取的温度为35℃时，溪黄草多酚的提取率可以达到最大值。