菌种固定化技术生产香芋普洱茶醋的研究

王 岩，蒋泽强，范海琼，张小玉，袁新建，龙浩然

(江苏食品药品职业技术学院 a.食品学院；b.江苏省食品加工工程技术研究开发中心，江苏 淮安 223005)

香芋是热带潮湿地区普遍种植的经济作物，是多年生天南星草本植物地下卵形至椭圆形的块茎，药食两用。香芋含有丰富的蛋白质、淀粉、脂类、维生素和钙、磷、铁等营养物质，还含有多糖、酚类等物质，具有健脾强胃、增强机体免疫力的作用[1-2]。普洱茶是云南省特有名茶，含有多酚类物质、游离氨基酸、咖啡因、茶多糖等成分，因其独特的风味及健康的特性备受国内外消费者和研究者的关注。普洱茶具有诸多保健功能，如降血糖、降血脂、抗衰老、抗过敏、预防癌症等[3]。本研究尝试把固定化发酵技术应用于香芋普洱茶醋的酿造工艺中，为生产高品质的香芋普洱茶醋提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

新鲜香芋(市售)；普洱熟茶(普尔思茅区)；白砂糖(食品级)；海藻酸钠(分析纯)；α-淀粉酶(100 000 IU/g)、α-1,4-葡萄糖水解酶(50 000 IU/g)：上海金穗生物科技有限公司；氯化钙(分析纯)；氢氧化钠(分析纯)；安琪生香酵母、安琪葡萄酒用酵母：安琪酵母有限公司；醋酸菌(沪酿1.01)：上海迪发生物公司。

1.2 仪器设备

YXQ-30SII高压灭菌锅：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；DHP-9052电热恒温培养箱：上海理达仪器厂；WH-YC-01恒温水浴摇床：苏州汶颢微流控技术股份有限公司；J-832小型打浆机：上海瑞派机械有限公司；XL-60C粉碎机：广州市旭朗机械设备有限公司；WZ-111-113手持式折光仪：浙江托普云农科技股份有限公司；PHS-3CW测定仪：北京九合仪器仪表有限公司；酒精计；酸碱滴定装置。

1.3 检测项目及检测方法

糖度：手持糖度计法；酒精度：酒精计法；总酸度：酸碱中和滴定法；微生物指标：GB 4789—2016。

1.4 菌种的固定化方法

取经活化后的菌悬液与6.0%的海藻酸钠溶液按照1∶1比例混合均匀，然后用注射器缓慢注入0.05 mol/L的氯化钙溶液中造粒，再将固定化颗粒置于4 ℃条件下的氯化钙溶液中保存24 h备用。

1.5 香芋普洱茶醋生产方法

1.5.1 香芋发酵前处理

香芋发酵前处理流程[4]见图1。

香芋→挑选、清洗→去皮、切片→护色→制浆→液化(α-淀粉酶酶解)→灭酶→糖化(α-1,4-葡萄糖水解酶酶解)→冷却

图1 香芋发酵前处理流程

1.5.2 普洱茶发酵前处理

普洱茶发酵前处理流程[5]见图2。

普洱茶→粉碎→浸提→冷却→过滤

图2 普洱茶发酵前处理流程

1.5.3 酒精发酵

酒精发酵流程见图3。

糖化香芋料液和普洱茶浸提液(3∶1比例)混合→调整酸度和糖度→接种固定化酿酒酵母→酒精发酵→酒醪

图3 酒精发酵流程

1.5.4 醋酸发酵

醋酸发酵流程见图4。

酒醪→调整酒精度→接种固定化醋酸菌→醋酸发酵→过滤→澄清→精滤→杀菌→成品

图4 醋酸发酵流程

2 结果与分析

2.1 酒精发酵阶段接种固定化酵母菌的配比对酒精度的影响

将糖化香芋料液和普洱茶浸提液按3∶1的比例混合后，调节料液起始pH值为4.5、酒精发酵糖度为16.0%；对料液进行灭菌处理后接种已固定化的酵母菌(酿酒酵母和生香酵母)，接种量为10%，控制发酵温度为32 ℃；酒精发酵时每日检测1次酒精含量，连续发酵6 d，计6次酒精含量，考察固定化酿酒酵母和生香酵母的比例对酒精产量的影响，结果见图5。在酒精发酵阶段，固定化酵母菌的菌种比例会对酒精产量产生影响，当酿酒酵母和生香酵母的比例为2∶1时，酒精产量最高。

图5 固定化酵母菌配比对酒精度的影响

2.2 酒精发酵阶段的料液起始糖度对酒精度的影响

将糖化香芋料液和普洱茶浸提液按3∶1的比例混合后，调节料液起始pH值为4.5，料液起始糖度分别为10.0%、12.0%、14.0%、16.0%和18.0%；对料液进行灭菌处理后接种已固定化的酵母菌(酿酒酵母和生香酵母的比例为2∶1)，接种量为10%，控制发酵温度为32 ℃；酒精发酵时每日检测1次酒精含量，连续发酵6 d，计6次酒精含量，考察料液起始糖度对酒精产量的影响，结果见图6。在酒精发酵阶段，发酵料液的起始糖度会对酒精产量产生影响，酒精产量随着糖度的增加而提高，待发酵6 d后，糖度为16.0%和18.0%时的酒精产量非常接近。综合考虑原料及后期醋酸发酵阶段，选择酒精发酵起始糖度为16.0%。

图6 起始糖度对酒精度的影响

2.3 酒精发酵阶段固定化酵母菌的接种量对酒精度的影响

将糖化香芋料液和普洱茶浸提液按3∶1的比例混合后，调节料液起始pH值为4.5、起始糖度为16.0%；对料液进行灭菌处理后接种已固定化的酵母菌(酿酒酵母和生香酵母的比例为2∶1)，接种量依次为6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%，控制发酵温度为32 ℃；酒精发酵时每日检测1次酒精含量，连续发酵6 d，计6次酒精含量，考察固定化酵母菌的接种量对酒精产量的影响，结果见图7。在酒精发酵阶段，酒精产量随着固定化酵母菌接种量的增加而提高，发酵4 d后，酒精产量增加幅度呈减缓趋势，继续增加接种量，并未显著提高酒精产量，而且还会加大固定化菌种制备的工作量。因此，选择固定化酵母菌的适宜接种量为10.0%。

图7 固定化酵母菌接种量对酒精度的影响

2.4 酒精发酵阶段发酵温度对酒精度的影响

将糖化香芋料液和普洱茶浸提液按3∶1的比例混合后，调节料液起始pH值为4.5、起始糖度为16.0%；对料液进行灭菌处理后接种已固定化的酵母菌(酿酒酵母和生香酵母的比例为2∶1)，接种量为10.0%，酒精发酵阶段发酵温度依次为28、30、32、34、36 ℃；酒精发酵时每日检测1次酒精含量，连续发酵6 d，计6次酒精含量，考察固定化酵母菌发酵温度对酒精产量的影响，结果见图8。在酒精发酵阶段，发酵温度低时发酵缓慢，发酵温度高时发酵迅速，但是发酵温度过高可能会造成酵母菌提前老化。因此，选择发酵温度为32 ℃。

图8 固定化酵母菌发酵温度对酒精度的影响

2.5 醋酸发酵阶段的起始酒精度对醋酸产量的影响

待酒精发酵结束，在酒精发酵的基础上进行醋酸发酵。醋酸发酵阶段的起始酒精度依次为6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%，固定化醋酸菌接种量为10.0%，控制发酵温度为34 ℃。醋酸发酵时每日检测1次总酸度，连续发酵6 d，计6次总酸度，考察起始酒精度对醋酸产量的影响，结果见图9。在醋酸发酵阶段，当酒精度低于10.0%时，醋酸产量随着起始酒精度的升高而逐渐提高；发酵4 d后，醋酸产量提高幅度呈减缓趋势；当酒精度高于10.0%时，因酒精度过高，醋酸发酵受到抑制，醋酸产量降低。因此，选择起始酒精度为8.0%。

图9 起始酒精度对醋酸产量的影响

2.6 醋酸发酵阶段固定化醋酸菌的接种量对醋酸产量的影响

调节醋酸发酵阶段的起始酒精度为8.0%，固定化醋酸菌接种量依次为6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%，控制发酵温度为34 ℃。醋酸发酵时每日检测1次总酸度，连续发酵6 d，计6次总酸度，考察固定化醋酸菌的接种量对醋酸产量的影响，结果见图10。在醋酸发酵阶段，固定化醋酸菌接种量对总酸度的影响较大，接种量低会导致发酵缓慢，接种量高则产酸效率提高，但会因菌体细胞的过快生长繁殖而消耗底物，从而影响醋酸产量。因此，选择固定化醋酸菌的接种量为10.0%。

图10 固定化醋酸菌接种量对醋酸产量的影响

2.7 醋酸发酵阶段发酵温度对醋酸产量的影响

调节醋酸发酵阶段的起始酒精度为8.0%，固定化醋酸菌接种量为10.0%，发酵温度依次为28、30、32、34、36 ℃。醋酸发酵时每日检测1次总酸度，连续发酵6 d，计6次总酸度，考察固定化醋酸菌发酵温度对醋酸产量的影响，结果见图11。在醋酸发酵阶段，发酵温度低时发酵进程缓慢，发酵温度高时发酵进程加快，但是发酵温度过高可能会造成醋酸菌提前老化。因此，选择发酵温度为34 ℃。

图11 固定化醋酸菌发酵温度对醋酸产量的影响

2.8 固定化菌种的发酵效果与非固定化菌种的发酵效果对比

将糖化香芋料液和普洱茶浸提液按3∶1的比例混合后，调节料液酒精发酵起始pH值为4.5、起始糖度为18.0%，对料液进行灭菌处理后，分别接种已固定化的酵母菌和非固定化的酵母菌，接种量为10.0%，设置发酵温度为32 ℃，开始酒精发酵。每日检测1次酒精含量，连续发酵6 d，计6次酒精含量，考察固定化酵母菌和非固定化酵母菌的发酵效果。酒精发酵结束后，在酒精发酵的基础上进行醋酸发酵，调节起始酒精度为8.0%、发酵温度为34 ℃，分别接种固定化醋酸菌和非固定化醋酸菌，接种量为10.0%，开始醋酸发酵。每日检测1次总酸度，连续发酵6 d，计6次总酸度，考察固定化醋酸菌和非固定化醋酸菌的发酵效果。固定化菌种与非固定化菌种的发酵效果对比见图12。不论是酒精发酵阶段，还是醋酸发酵阶段，固定化菌种参与的发酵效果要优于非固定化菌种参与的发酵，这主要是由于固定化发酵系统中的酵母菌或醋酸菌浓度很高，发酵过程中也会有游离态的酵母菌或醋酸菌不断泄露，同凝胶内的酵母菌或醋酸菌共同促进产物的生成。

图12 固定化菌种发酵与非固定化菌种发酵效果对比

2.9 香芋普洱茶醋的质量指标

2.9.1 产品感官指标

色泽棕黄，均匀一致，醋香浓郁，具有香芋风味，伴有茶香，无异味，适口性良好。

2.9.2 理化指标

总酸(以醋酸计)≥45.0 g/L；还原糖(以葡萄糖计)≥10 g/L；氨基酸态氮≥0.9 g/L。

2.9.3 微生物指标

细菌总数≤100 cfu/mL；大肠菌群≤2 cfu/mL；致病菌未检出。

3 结论

以香芋和普洱茶为原料，采用菌种固定化技术生产香芋普洱茶醋。酒精发酵阶段，起始糖度为16.0%，固定化酵母菌(酿酒酵母和生香酵母的比例为2∶1)接种量为10.0%，发酵温度为32 ℃；醋酸发酵阶段，起始酒精度为8.0%，固定化醋酸菌接种量为10%，发酵温度为34 ℃。菌种固定化发酵效果优于菌种非固定化发酵，所得香芋普洱茶醋具有良好的质量指标。