聚合R基因Pigm和非R基因bsr-d1改良水稻稻瘟病抗性

王 亚，王越涛，申关望，王付华，王生轩，白 涛，尹海庆

(1.河南省农业科学院 粮食作物研究所，河南 郑州 450002；2.信阳市农业科学院 水稻研究所，河南 信阳 464000)

稻瘟病是我国水稻主产区的第一大毁灭性病害，由子囊菌(Magnaporthegrisea(Hebert)Barr)引起[1]。稻瘟病在发病严重的年份可导致水稻颗粒无收，严重制约了我国水稻生产的发展[2-3]。相比使用化学农药，种植抗稻瘟病水稻品种更能经济有效地控制稻瘟病。由于稻瘟病生理小种繁多且容易变异，抗病品种经常丧失抗性而沦为感病品种，从而造成严重损失，生产上急需广谱持久抗稻瘟病水稻新品种。稻瘟病抗性分为完全抗性(主效R基因控制)和部分抗性(非R基因控制)2种[4]。其中，完全抗性的主效基因易于操作，在水稻育种和生产中已得到广泛应用。部分抗性的抗性水平虽然较完全抗性低，但抗性相对稳定和持久。完全抗性与部分抗性的结合利用将是未来水稻抗稻瘟病育种的方向和趋势[5]。源自持久抗性品种谷梅4号的显性主效R基因Pigm是一个包含多个NBS-LRR类抗病基因的基因簇，其中只有2个具有功能的蛋白质PigmR和PigmS。PigmR可以发挥广谱抗病功能，但会导致水稻千粒质量降低，产量下降；PigmS则可以提高水稻的结实率，抵消PigmR对产量的影响，PigmS可以通过与PigmR竞争形成异源二聚体抑制PigmR介导的广谱抗病性。但由于PigmS低水平的表达使得病原菌的进化选择压力变小，减缓了病原菌对PigmR的致病性进化，因此，Pigm介导的稻瘟病抗性更持久并且不影响最终产量[6]。bsr-d1是从广谱持久抗病材料地谷中克隆的非R类广谱抗稻瘟病基因。研究表明，由于Bsr-d1基因的启动子区域一个关键碱基的变异，导致上游MYB转录因子对Bsr-d1启动子结合增强而使得Bsr-d1基因表达受到抑制，进而导致Bsr-d1直接调控的H2O2降解酶基因表达下调，使H2O2降解减弱，细胞内H2O2富集，提高了水稻的免疫反应并因此获得稻瘟病抗性；敲除Bsr-d1在增强水稻稻瘟病抗病性的同时，对产量性状和稻米品质没有明显影响，因而具有十分重要的应用价值[7]。

稻米优质化是水稻生产“供给侧改革”的重要内容，也是水稻产业提质增效的重要抓手。水晶3号是河南省优良食味水稻的标志性品种，但由于稻瘟病抗性差，极大限制了该品种的推广应用，生产上急需具有广谱持久稻瘟病抗性的优质稻品种。通过分子育种手段直接改良现有优质水稻资源的稻瘟病抗性，是培育抗稻瘟病优质水稻新品种的快速有效手段。CRISPR/Cas9系统是近几年迅速发展起来的能够便捷、高效、精准敲除靶基因的基因编辑技术，且成本低廉[8-10]。该技术主要原理是利用 gRNA与基因组上目标序列的特异性识别，引导Cas9核酸酶在靶标位置切割DNA使之双链断裂，进而导致基因组DNA在修复过程中发生碱基的缺失、插入或替换等特异性突变[11]。获得的基因编辑材料通过后代自交分离能够剔除外源基因，不会留下转基因痕迹[12-13]。此外，随着DNA 测序技术的迅猛发展，测序成本大大降低，分子标记检测技术逐渐实现了高通量、低成本和自动化，为育种应用奠定了坚实基础。选择综合性状优良的品种，针对其突出缺点，精准导入目标性状基因，利用基于基因芯片的分子标记检测技术进行单个分子标记的前景选择和高通量的背景选择能够灵活、高效地实现分子标记辅助回交育种的目标[14]，从而实现高产、优质、抗病的统一。

本研究首先利用CRISPR/Cas9系统对优良食味水稻品种水晶3号中的Bsr-d1进行定点编辑，在T0获得纯合的Bsr-d1敲除材料，经自交分离获得去除转基因成分的T1纯合敲除材料，然后以这些材料为母本与携带Pigm基因的金玉1号(粳稻)杂交并连续回交3代，采用武汉双绿源公司的水稻绿色基因芯片(GSR40K)进行Pigm基因分子标记选择和高通量的背景选择，获得同时携带主效R基因Pigm和非R基因bsr-d1且遗传背景基本回复的水晶3号抗稻瘟病材料，从而为水稻抗稻瘟病育种提供有重要价值的材料。

1 材料和方法

1.1 水稻材料、载体与菌株

水晶3号来自河南省农业科学院粮食作物研究所，金玉1号(转育并携带Pigm基因)由江苏里下河地区农业科学研究所提供。

CRISPR/Cas9双元表达载体pBGK032来自百格基因科技(江苏)有限公司。大肠杆菌DH-5α和农杆菌EHA105由河南省农业科学院粮食作物研究所水稻研究室保存。

1.2 CRISPR-Cas9-Bsr-d1表达载体构建

利用targetDesign(http：//skl.scau.edu.cn/targetdesign/)进行gRNA靶位点的设计。根据水稻生物学网站(http：//rice.plantbiology.msu.edu/)提供的Bsr-d1(LOC_Os03g32230)基因序列，选择PAM(Protospacer adjacent motif)序列(NGG)上游约20 bp片段为靶位点序列(GGCGAAGGCCTTCCCGCAGA)，利用 NCBI 对水稻基因组进行 Blast 以分析确认靶位点的特异性。靶位点序列正义链和反义链设计，是在靶序列的5′端添加GTGT，靶序列互补链的5′端添加AAAC，使其与质粒经BsaⅠ酶切后形成黏性互补末端：正义链GTGTGGCGAAGGCCTTCCCGCAGA，反义链AAACTCTGCGGGAAGGCCTTCGCC。2条引物65 ℃退火5 min形成互补双链 DNA，直接用于后续的载体构建。

对pBGK032双元载体进行酶切：pBGK032质粒2 μg，10×NEB缓冲液5 μL，BsaⅠ 10 U，加ddH2O至50 μL。酶切后用DNA纯化试剂盒进行纯化，然后用T4连接酶将线性化的pBGK032(10 ng)与靶序列双链 DNA(0.05 mmol/L)进行过夜连接，采用热激法将连接产物转化大肠杆菌DH-5α。根据载体序列信息设计上下游引物Cas9-F/Cas9-R(Cas9-F：CCATGAAGCCTTTCAGGACATGTA，Cas9-R：ACGCTGCAAACATGAGACGGAGAA)进行PCR鉴定，经测序验证无误的重组表达载体命名为CRISPR-Cas9-Bsr-d1，并转化到农杆菌 EHA105中。

1.3 水稻遗传转化及无 T-DNA元件的bsr-d1纯合突变体筛选

将携带CRISPR-Cas9-Bsr-d1重组质粒的农杆菌EHA105 转化受体水稻品种水晶3号的愈伤组织，在含有潮霉素的培养基上筛选有抗性的再生组培苗即T0植株。将组培苗经过炼苗后转移到温室种植，采用CTAB法于四叶期提取叶片DNA，用潮霉素抗性基因特异性引物Hyg-F/Hyg-R(Hyg-F：CGAGAGCCTGACCTATTGCAT，Hyg-R：CTGCTCCATACAAGCCAACCAC)进行PCR扩增，能扩增出481 bp目标条带的即为阳性转基因植株。

设计能够扩增含有CRISPR/Cas9靶序列的特异性引物(GP-F：GAGGTCGAAGTTCCTGACGG，GP-R：GGCGATCAACAAGGAGGAGT)，以上述阳性转基因植株DNA为模板扩增目的条带(长度约为490 bp)，将PCR产物送上海生工生物公司测序，以野生型水晶3号Bsr-d1基因序列为参考，采用在线分析软件DSDecodeM(http：//skl.scau.edu.cn/dsdecode/)对测序结果进行比对分析，以明确突变位点的具体情况。根据测序获得的水晶3号不同类型突变体中的编码序列，利用BioEdit软件翻译成蛋白质序列并进行多重序列比对，然后将比对结果保存为Fasta格式，利用ClustalX软件转换为MSF格式，然后用GeneDoc软件分析各突变单株氨基酸序列的变化情况。

筛选得到的T0纯合突变株经自交结实后得到T1种子，将T1种子播种成苗移栽后提取叶片基因组DNA，用载体特异引物Hyg-F/Hyg-R进行PCR扩增，无法扩增出目的条带的植株即为无T-DNA成分的T1单株。

1.4 无T-DNA元件的bsr-d1纯合突变体中抗稻瘟病基因 Pigm的导入

2019年夏季在原阳试验基地以无T-DNA成分的T1单株为母本，以携带Pigm基因的金玉1号为父本，杂交获得F1。2019年冬单株种植于温室，利用武汉双绿源创芯科技研究院有限公司研制的GSR40K高密度水稻基因芯片(基于Illumina芯片制造技术开发的SNP 芯片，包含了丰富的多态性标记、重要农艺性状的功能基因标记和单倍型标记以及用于定位 QTL标记)，筛选出携带Pigm基因的单株，以野生型水晶3号为轮回亲本，连续回交3代，采用GSR40K基因芯片同时进行目标基因和背景选择，获得BC3F1。2020年冬选择含Pigm基因且背景回复好的重组单株自交一次，获得BC3F2。对BC3F2进行前景及背景选择，最终获得抗病基因(同时携带bsr-d1和Pigm基因)纯合，且背景基本回复的水晶3号改良系。

1.5 水晶3号改良株系幼苗期的叶瘟抗性鉴定

将同时携带bsr-d1和Pigm基因的水晶3号改良株系及其野生型对照培养至五叶期，剪取5～6 cm长的水稻顶端完全伸展的叶片，用接种针在主脉间隔一定距离划3个伤口且不穿透叶片，然后置于平皿内保湿的滤纸上。参考徐鹏等[15]的方法，将稻瘟病菌(GUY11由福建农林科技大学刘建平老师提供)制成分生孢子悬浮液(2×105个/mL)。用移液枪在叶片伤口处点滴15 μL的孢子液，随即在25 ℃黑暗条件下保湿培养30 h。然后将光照时间调整为14 h，温度保持在25 ℃，湿度饱和。接种后5 d观察病斑大小。

1.6 水晶3号改良株系接种稻瘟病菌前后的生理指标测定

将获得的携带bsr-d1和Pigm基因的水晶3号改良株系及野生型对照材料培养至四叶一心期，用分生孢子悬浮液活体喷雾处理，分别在接种0，2，5 d时取叶片测定各材料生理指标。利用商业化试剂盒(苏州科铭)结合酶标仪对过氧化物酶(POD)活性[16]和过氧化氢(H2O2)含量[17]进行测定(具体方法参照试剂盒说明书)，以上均以未接种的材料为对照，3次重复。

2 结果与分析

2.1 Bsr-d1靶位点设计和CRISPR-Cas9-Bsr-d1表达载体构建

首先对日本晴、水晶3号和地谷中Bsr-d1基因的功能位点区段进行PCR产物测序，发现地谷Bsr-d1基因启动子功能位点的碱基为G，而水晶3号和日本晴在同一位点的碱基为A(图1-A)，说明水晶3号不具有bsr-d1介导的稻瘟病抗性。然后根据日本晴中Bsr-d1基因序列设计扩增引物Bsr-d1-F/Bsr-d1-R(GCTCATCATCCATCCATCTC/GGCGACAATCAATCTTGG)，以水晶3号基因组DNA为模板进行 PCR 扩增并对扩增产物进行测序，发现水晶3号中Bsr-d1基因与数据库中公布的日本晴Bsr-d1完全一致，整个CDS区只有1个外显子，长度为663 bp，编码220个氨基酸。根据CRISPR-Cas9靶位点设计原则，在Bsr-d1基因编码区靠近ATG一端设计20 bp的gRNA靶序列GGCGAAGGCCTTCCCGCAGA，靶序列3′端为PAM序列CGG(图1-B)。退火形成的双链互补靶序列经BsaⅠ酶切后与双元载体pBGK032连接形成重组载体CRISPR-Cas9-Bsr-d1(图1-B)。对重组质粒进行 PCR 扩增，目标片段长度约为361 bp，符合预期结果，表明CRISPR-Cas9-Bsr-d1表达载体构建成功。选取验证片段大小正确的菌株抽提质粒，经测序验证无误后，将阳性质粒转入农杆菌 EHA105。

图1 不同水稻品种中Bsr-d1基因启动子的功能位点分析(A)及CRISPR-Cas9-Bsr-d1重组载体信息(B)Fig.1 Functional locus of Bsr-d1 gene promoter in different rice varieties(A)and schematic information of the CRISPR-Cas9-Bsr-d1 recombinant vector(B)

2.2 T0转基因阳性株的获得及靶位点的突变分析

通过农杆菌介导的方法将构建好的CRISPR-Cas9-Bsr-d1重组表达载体导入水晶3号愈伤组织，经潮霉素筛选，共获得34个独立转化体。将获得的转基因植株炼苗后转移至温室培养，四叶期时提取叶片DNA用潮霉素抗性基因引物Hyg-F/Hyg-R进行PCR扩增，发现34个独立转化体均携带有潮霉素抗性基因，阳性率达到100%(图2)。为了解水晶3号中Bsr-d1基因的突变情况，以上述叶片DNA为模板用能够扩增含有CRISPR/Cas9靶序列的特异性引物GP-F/GP-R进行PCR扩增(图2)，并对 PCR 产物进行测序分析，利用在线分析软件DSDecodeM进行序列解码。结果表明，有21株阳性转基因苗在靶位点处发生了突变，突变率为61.8%；突变基因型包括纯合突变和杂合突变，其中有8株为纯合突变，占38.1%，13株为杂合突变，占61.9%；纯合突变类型包括碱基插入和缺失(图3-A)，其中T插入占25.0%，GA缺失占37.5%，G插入及CGCA和CGCAGA碱基缺失各占12.5%。氨基酸序列比对结果表明，与野生型Bsr-d1基因的氨基酸序列相比，编辑后的Bsr-d1基因由于出现碱基的插入或缺失造成了移码突变(SJ3+T、SJ3+G、SJ3-2和SJ3-4)，导致氨基酸序列组成出现较大变化或翻译提前终止；CGCAGA碱基缺失则导致了整码突变，在77，78位置缺失了缬氨酸和半胱氨酸2个氨基酸，其他氨基酸则无变化(图3-B)。以上突变体氨基酸的变化有可能造成蛋白质功能的丧失。

Marker.2000 bp DNA标准分子质量；+.Hyg基因的阳性对照；-.双蒸水；1—34.34个T0 独立转化体。Marker.2000 bp DNA Marker；+.Positive control of Hyg；-.ddH2O；1—34.34 independent transformants in T0 generation.

2.3 无T-DNA元件的bsr-d1纯合突变体筛选及抗稻瘟病基因 Pigm的导入

为快速获得不包含T-DNA元件的bsr-d1纯合突变株用于后续研究，将T0的5种类型的纯合突变株系自交，结实后得到T1种子，将T1种子播种，成苗后提取叶片基因组DNA，用载体特异引物Hyg-F/Hyg-R进行PCR扩增，无法扩增出481 bp目的条带的植株即为无转基因成分的bsr-d1纯合突变体(图4)。以无转基因成分的bsr-d1纯合突变体基因组DNA为模板，利用靶点检测特异性引物GP-F/GP-R进行PCR扩增，PCR产物测序表明无转基因成分的bsr-d1纯合突变体靶位点突变情况与T0是一致的，说明这5种Bsr-d1单基因突变类型在剔除Cas9载体骨架后能够稳定遗传。

A．T0转基因水晶3号的5 种纯合突变体类型；B．Bsr-d1基因野生型及5种纯合突变类型的氨基酸序列分析:SJ3.野生型,SJ3+T.T碱基插入,SJ3+G.G碱基插入,SJ3-2.GA碱基缺失,SJ3-4.CGCA碱基缺失,SJ3-6.CGCAGA碱基缺失。A.Five types of homozygous mutants of Shuijing 3 in T0 generation；B.Bsr-d1 gene amino acid sequences in the wild type and five homozygous mutant lines:SJ3.Wild type,SJ3+T.T base insertion,SJ3+G.G base insertion,SJ3-2.GA bases deletion,SJ3-4.CGCA bases deletion,SJ3-6.CGCAGA bases deletion.

Marker.2000 bp DNA标准分子质量；1—24.24个T1 单株。Marker.2000 bp DNA Marker；1—24.24 independent plants in T1 generation.

以无T-DNA成分的T1bsr-d1纯合突变体为母本，以携带Pigm基因的金玉1号为父本，杂交获得F1，利用GSR40K基因芯片筛选出携带Pigm基因的F1单株，以水晶3号为轮回亲本，连续回交3代获得BC3F1，根据芯片检测结果选择含Pigm基因且背景回复好的重组单株自交一次，获得BC3F2，并筛选获得抗病基因(同时携带bsr-d1和Pigm基因)纯合，且背景基本回复的水晶3号改良植株(图5，以T碱基插入突变体为例)。携带Pigm基因的水晶3号bsr-d1纯合突变体SJ3+T、SJ3+G、SJ3-2、SJ3-4、SJ3-6的背景回复率分别为97.86%，96.71%，97.39%，97.52%，96.79%，将以上水晶3号改良系依次命名为SJ3-G1、SJ3-G2、SJ3-G3、SJ3-G4、SJ3-G5。

蓝色.杂合基因位点；红色.纯合Pigm基因位点。Blue.Heterozygous gene locus；Red.Homozygous Pigm locus.

2.4 水晶3号改良株系幼苗期的叶瘟抗性鉴定

采用离体水稻叶片划伤接种稻瘟病菌方法鉴定不同类型水晶3号改良株系幼苗期对稻瘟病菌的抗性，接种5 d后对病斑叶片进行拍照 (图6)。从图6可以看出，野生型水晶3号叶片感病比较严重，病斑面积明显大于水晶3号各改良株系。以上结果表明，同时携带bsr-d1和Pigm基因的水晶3号各改良株系在幼苗期对稻瘟病菌生理小种GUY11引起的叶瘟抗性均明显提高。但是否对其他稻瘟病菌生理小种产生抗性及穗颈瘟抗性如何，仍需进一步接种鉴定。

图6 水晶3号改良株系及其野生型对照的稻瘟病菌接种鉴定结果Fig.6 Identification of improved strains of Shuijing 3 and the wild-type control after inoculation with M.coryza

2.5 水晶3号改良株系接种稻瘟病菌前后的生理指标测定

水稻幼苗未接种稻瘟病菌时，SJ3-G1、SJ3-G3株系叶片中POD活性与对照相比显著降低，SJ3-G2、SJ3-G4、SJ3-G5株系叶片中POD活性则与对照无显著差异；接种稻瘟病菌2，5 d后，水晶3号改良系叶片中POD活性均显著低于对照(图7-A)。未接种稻瘟病菌时，各改良株系叶片中H2O2含量与对照无显著差异；接种稻瘟病菌2，5 d后，水晶3号改良系叶片中H2O2含量均显著高于对照(图7-B)。不论对照还是改良系，叶片中H2O2含量均随着接种时间的增加而呈增加趋势，POD活性变化不明显。

柱上不同小写字母表示野生型和各改良株系在接种后同一时期0.05水平上差异显著(t测试)。Different lowercase letters above the bars indicate significant difference between the wild type and the improved lines at the 0.05 levels by t-test at the same stage.

3 结论与讨论

CRISPR/Cas9基因编辑技术由于具有精准、便捷、高效、成本低廉等优点，已经在水稻稻瘟病抗性遗传改良中得到了广泛应用。Wang等[18]利用 CRISPR/Cas9 系统定向编辑水稻稻瘟病负调控基因OsERF922，从50株阳性转化体中鉴定到21株T0突变株，经过自交分离，最终获得6个稻瘟病抗性明显增强且无外源基因成分的T2纯合突变株系，CRISPR/Cas9技术可以在不影响其他农艺性状的前提下实现对水稻抗病性的改良。杨海河等[19]利用CRISPR-Cas9技术对水稻稻瘟病感病品种日本晴pi21基因进行定点突变，最终获得了21株不含T-DNA转基因序列的pi21纯合突变体，对其中1个pi21突变株系进行稻瘟病菌孢子喷雾接种，发现突变株系的抗病性显著高于野生型日本晴。徐鹏等[15]利用CRISPR/Cas9系统对长粒粳稻恢复系L1014中Pita、Pi21和ERF922进行定点编辑，获得了Pi21单突变株系和Pita、Pi21、ERF922三突变株系，接种鉴定结果表明，突变株系的稻瘟病抗性比野生型显著提高。

编码 C2H2 类转录因子的Bsr-d1基因是从广谱抗稻瘟病品种地谷中鉴定出来的，由于该基因通过RNAi或CRISPR/Cas9技术被敲除后，水稻品种TP309的稻瘟病抗性明显提高，因此，bsr-d1被认为是一个调控水稻稻瘟病广谱抗性的新的遗传位点[7，20]。bsr-d1为转录因子，其介导的稻瘟病抗性属于非R类部分抗性，抗性相对稳定和持久。bsr-d1主要分布在籼型水稻资源中，在粳型资源中几乎不存在[21]。因此，为了快速获得具有广谱持久稻瘟病抗性的水晶3号，本研究首先利用CRISPR/Cas9系统定向编辑Bsr-d1基因，并通过自交分离获得了不含T-DNA转基因成分的水晶3号bsr-d1纯合突变株系，包括T插入、G插入、GA缺失、CGCA缺失和CGCAGA缺失5种类型，突变类型较为丰富。34个T0转基因植株中Bsr-d1基因的突变率为61.8%，其中有8株为纯合突变体。纯合变变类型中GA缺失型最多，占全部纯合突变体的37.5%，其次为T插入占25.0%，G插入及CGCA和CGCAGA碱基缺失则各占12.5%。氨基酸序列分析结果表明，以上5种突变类型均导致了Bsr-d1氨基酸序列组成的变化或翻译提前终止，很有可能造成蛋白质功能的丧失，从而使得水晶3号获得稻瘟病抗性。

研究认为，完全抗性与部分抗性结合利用在抗稻瘟病育种中有重要的应用价值[5]。作为公认的持久广谱抗稻瘟病基因，Pigm目前在河南沿黄粳稻育种中还没有得到充分利用[22]，因此，本研究在获得Bsr-d1纯合突变株系的基础上，经杂交、回交、自交并采用武汉双绿源创芯科技研究院有限公司的GSR40K高密度水稻基因芯片进行前景和背景选择，大大缩短了育种周期，只经过4代就将粳稻金玉1号中的Pigm基因导入以上突变株系中，并最终获得抗病基因(同时携带bsr-d1和Pigm基因)纯合，且背景基本回复(背景回复率均在96%以上)的水晶3号改良植株即SJ3-G1、SJ3-G2、SJ3-G3、SJ3-G4、SJ3-G5。稻瘟病菌接种鉴定结果表明，与野生型水晶3号相比，改良株系叶片上的病斑面积明显变小，稻瘟病抗性明显提高。

研究表明，适度提高H2O2含量能够增强水稻稻瘟病抗性[23]。bsr-d1通过调控过氧化氢酶基因的表达调节H2O2的积累，从而影响水稻的稻瘟病抗性。敲除Bsr-d1基因能够显著降低过氧化物酶基因的表达量，进而减弱其对H2O2的降解引起细胞内H2O2的富集，从而提高水稻植株抗病性[7]。本研究发现，接种稻瘟病菌后，水晶3号改良株系叶片中POD活性显著低于其野生型对照，H2O2含量则正好相反，改良株系叶片中H2O2含量显著高于其野生型对照。这与以前的研究结果是一致的，证明稻瘟病抗性与H2O2含量存在一定正相关关系，而与POD活性则存在一定负相关关系，很有可能是因为Bsr-d1基因被敲除后，引起活性氧清除相关酶类基因的表达下调，细胞内H2O2在一定程度上得以富集从而使水稻植株获得了稻瘟病抗性，至于Pigm在这种调节机制中的具体作用还需要深入研究。

本研究通过CRISPR/Cas9系统结合分子标记辅助选择获得了同时携带bsr-d1和Pigm基因且无外源转基因成分的水晶3号改良株系，并证实这些改良株系在苗期由于POD活性的降低和H2O2含量的增加一定程度上提高了对稻瘟病生理小种GUY11的抗性，但对其他稻瘟病生理小种是否具有抗性、穗颈瘟抗性如何、主效R基因和非R基因结合产生的抗性能否持久稳定、bsr-d1和Pigm基因之间存在何种关系，这些都还需要进一步研究。本研究为培育具有广谱持久稻瘟病抗性的优质水稻新品种提供了重要的资源。在此基础上，利用多种稻瘟病菌生理小种研究水晶3号改良系的抗性谱，开展多年多生态点抗性鉴定尤其是穗颈瘟抗性鉴定以明确抗性是否持久，同时开展产量、品质等其他农艺性状鉴定，并利用这些材料改良其他骨干水稻亲本的稻瘟病抗性，将是未来研究的重点方向。