草地早熟禾蛋白激酶SnRK2.4基因克隆及非生物胁迫响应分析

金一锋，高岩松，王 琦，王萌萌，赵 迪，熊 毅，陈 阳

(1.齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

草地早熟禾(PoapratensisL.)是优质的冷季型草坪草之一，被广泛用于温带和寒温带，其具有较强的耐低温、耐修剪、绿期较长等优点[1]。现阶段园林城市绿化建设中草坪养护管理时期常面临干旱、盐胁迫、氮肥利用率低等情况，提升草坪草的耐旱、耐盐、耐养分环境等可以一定程度上降低草坪草管理成本，探究草坪草响应逆境胁迫信号的机制十分必要。蛋白激酶是植物逆境防御机制中的重要核心成分，其中蔗糖非发酵相关蛋白激酶(SnRK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在植物逆境胁迫响应中发挥重要作用[2-3]。SnRK家族可分为3类，分别为SnRK1、SnRK2、SnRK3，其中SnRK2和SnRK3是植物所特有的蛋白激酶，研究发现，拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(OryzasativaL.)、小麦(TriticumaestivumL.)等SnRK2s和SnRK3s家族成员积极参与ABA信号传导及多种非生物胁迫[4-5]。

现有禾本科植物蛋白激酶SnRK相关研究主要集中在水稻、二穗短柄草(BrachypodiumdistachyonL.)、小麦等，但有关禾本科草坪草SnRK的功能研究鲜有报道。水稻SnRK2家族成员，又被命名为 SAPK(Osmotic stress/ ABA-activated protein kinase)，研究发现，过表达OsSAPK4可以改善幼苗及成熟植株在盐胁迫下的发芽及生长发育情况[6]。Krzywińska等[7]研究表明，PP2CA可以与ABI1和SnRK2.4一起调节拟南芥根系生长以适应盐胁迫。Szymańska等[8]研究表明，SnRK2.4可以调节盐胁迫的幼苗中过氧化氢酶水平及其活性和抗坏血酸水平。马铃薯SnRK2.4基因受低温、干旱和盐胁迫诱导[9]。二穗短柄草多个SnRK2s家族成员受冷、干旱、盐、ABA、ETH、H2O2胁迫的诱导[10]。

本试验以草地早熟禾为研究对象，克隆得到SnRK2.4基因，利用生物信息学分析其编码序列特征，利用实时荧光定量PCR方法分析该基因的组织特异性，以及非生物胁迫中的表达模式，以期为揭示草地早熟禾SnRK2.4基因逆境应答分子机理提供理论基础，这也将丰富草坪草SnRK2抗逆机制的相关研究。

1 材料和方法

1.1 试验材料及处理方法

试验于 2021年4—8月进行，供试材料为草地早熟禾午夜Ⅱ号品种。选取试验地中长势较好的植株，根部洗净后置于水培液中，每2 d浇灌1次1/2 Hoagland水培液，待培养14 d后进行非生物胁迫处理。具体处理为：①干旱胁迫：1/2 Hoagland营养液中加入10% PEG6000，模拟干旱处理0，2，16 h，对其根部、叶部进行取样。②盐胁迫处理：配置0，30，100，300 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland营养液。③氮素胁迫：采用NaNO3为氮源，配置3种氮素梯度的营养液，NaNO3浓度分别为0，1.5，15.0 mmol/L NaNO3。④磷素胁迫：采用磷酸二氢钾KH2PO4为磷源，配置3种磷素梯度的营养液，KH2PO4浓度分别为0，0.01，1.00 mmol/L KH2PO4，盐、氮素、磷素水培液均为每天更换，14 d后对整株材料进行取样，样本均保存于-80 ℃。⑤ABA、BR处理：ABA浓度为5，15 mg/L，每天喷施于叶部，于0，7，21 d 取样。BR浓度为0.1，1.0 mg/L，每天喷施于叶部，于0，7，21 d取样，样本均保存于-80 ℃。

1.2 草地早熟禾SnRK2.4基因的克隆及生物信息学分析

本研究参照植物总RNA提取试剂盒(TianGen，北京)提取供试材料的总RNA，并进行总RNA浓度、纯度OD值的检测。以检测合格后的总RNA为模板，采用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，日本)获得cDNA第一条链，用于草地早熟禾SnRK2.4基因的克隆。园林植物育种实验室前期获得的草地早熟禾转录组数据库(NCBI登录号：PRJNA517968)作为基础，结合GenBank公布的二穗短柄草SnRK2.4(NP_001304812.1)、水稻SnRK2.4(NP_001383791.1)，设计特异性引物SnRK2.4-F、SnRK2.4-R(表1)。以cDNA为模板进行RT-PCR，反应程序为：94 ℃ 预变性2 min；94 ℃ 变性30 s，退火58 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s，共32个循环；最终延伸72 ℃ 2 min，获得草地早熟禾SnRK2.4基因序列。引物合成和PCR扩增产物的测序均由生工生物工程股份有限公司(上海)完成。

本研究利用NCBI-ORF预测SnRK2.4开放性阅读框，用NCBI CD-Search分析该蛋白保守结构功能域；利用MEGA 7.0、MEME构建SnRK2.4系统进化树；利用ClustalW 进行SnRK2.4编码氨基酸同源性分析；利用 ProtParam分析基本理化性质，用Motifscan 分析生物活性位点；利用SOPMA在线预测SnRK2.4蛋白质的二级、三级结构。

1.3 草地早熟禾SnRK2.4基因组织特异性及非生物胁迫表达模式分析

本研究提取草地早熟禾植株不同部位(根部、茎部、叶部、穗部)的RNA；提取干旱、盐、氮、磷、ABA、BR胁迫后的草地早熟禾叶部RNA，以不同样本的RNA模板反转录获得第一条cDNA，作为qRT-PCR模板。qRT-PCR总反应体系为50 μL，包含4 μL cDNA，2 μL Q-SnRK2.4-F，2 μL Q-SnRK2.4-R，25 μL TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (TaKaRa)，17 μL ddH2O。qRT-PCR扩增程序为：95 ℃预变性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环；内参基因为UBQ，qRT-PCR引物见表1。该试验生物学、试验重复各3次，采用2-ΔΔCt法处理数据，采用SPSS 13.0、GraphPad Prism 7.0进行数据处理。

表1 所需RT-PCR及qRT-PCR引物Tab.1 The primers used for RT-PCR and qRT-PCR

2 结果与分析

2.1 草地早熟禾SnRK2.4基因编码区克隆及生物信息学分析

利用草地早熟禾cDNA为模板，以及引物SnRK2.4-F/R，PCR扩增得到约为1 242 bp的条带(图1)，其包含一个1 092 bp开放阅读框，共编码363个氨基酸，预测SnRK2.4蛋白分子质量为42.25 ku，分子式为C1845H2910N528O568S21，等电点为5.71。草地早熟禾SnRK2.4 属于SRK/SAPK 家族丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，含有STKc_SnRK2结构域(图2)。将草地早熟禾SnRK2.4与多个植物SnRK2.4氨基酸进行同源比对(图3)，结果显示，草地早熟禾SnRK2.4与二穗短柄草SnRK2.4(NP_001304812.1)、大麦SnRK2.4(XP_044977561.1)同源性最高，分别为90.91%，90.08%。利用NetPhos-3.1分析草地早熟禾SnRK2.4磷酸化位点，其包含16个丝氨酸、12个苏氨酸和7个酪氨酸磷酸化位点。将草地早熟禾SnRK2.4及多个禾本科植物(二穗短柄草、大麦、长穗偃麦草)SnRK2.4进行蛋白生物活性位点的预测，结果表明，草地早熟禾SnRK2.4含有1个cAMP 和 cGMP 依赖性蛋白激酶磷酸化位点(247—250 aa)，3个酪氨酸激酶磷酸化位点(40—46 aa，94—102 aa，140—146 aa)，9个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(6—9 aa，96—99 aa，172—175 aa，222—225 aa，250—253 aa，285—288 aa，290—293 aa，319—322 aa，346—349 aa)，1个N-肉豆蔻酰化位点(110—115 aa)，1个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点(119—131 aa)，1个蛋白激酶 ATP 结合区域(10—33 aa)，1个富含谷氨酸的区域(317—342 aa)(图4)。图5-A为草地早熟禾SnRK2.4蛋白质的二级结构，其包含41.05% α-螺旋，39.12%不规则卷曲，14.88%延伸链和4.96%β-转角，图5-B为草地早熟禾SnRK2.4蛋白的三级结构，与二级结构结果一致。

图1 草地早熟禾SnRK2.4 基因PCR扩增产物的电泳Fig.1 Electropherogram of PCR-amplified products of SnRK2.4

图2 草地早熟禾SnRK2.4氨基酸的保守结构域分析Fig.2 Conserved domain analysis of SnRK2.4 in kentucky bluegrass

图3 草地早熟禾与其他植物SnRK2.4的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of SnRK2.4 in kentucky bluegrass and other plants

Ⅰ.蛋白激酶ATP结合信号区；Ⅱ.丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点；Ⅲ.富含谷氨酸的区域；-.cAMP 和 cGMP 依赖性蛋白激酶磷酸化位点；=.N-肉豆蔻酰化位点；#.酪氨酸激酶磷酸化位点；^.酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。Ⅰ.Protein kinase ATP binding signal domain；Ⅱ.Serine/threonine protein kinase active site；Ⅲ.Glutamate-rich region；-.cAMP and cGMP-dependentprotein kinase phosphorylation site；=.N-Myristoylation site；#.Tyrosine kinase phosphorylation site；^.Casein kinase Ⅱphosphorylation site.

2.2 草地早熟禾SnRK2.4基因表达水平的分析

2.2.1 草地早熟禾SnRK2.4基因组织特异性 利用实时荧光定量PCR测定草地早熟禾不同组织部位的SnRK2.4相对表达量，结果显示，SnRK2.4基因相对表达量存在组织特异性(P<0.05)，由图6可见，穗部SnRK2.4基因相对表达量最高，根部、茎部和叶部之间的相对表达量无显著差异，穗中相对表达量是叶部的23.91倍。

2.2.2 草地早熟禾SnRK2.4对逆境胁迫的响应 由图7-A可知，随着10% PEG6000胁迫时间的增加，草地早熟禾SnRK2.4基因相对表达量显著增加(P<0.05)，16 h 的相对表达量是0 h的10.31倍。NaCl处理显著促进SnRK2.4基因的表达(P<0.05)，300 mmol/L NaCl>100 mmol/L NaCl>30 mmol/L NaCl>0 mmol/L NaCl(CK)，300 mmol/L NaCl的相对表达量是0 mmol/L NaCl的17.78倍(图7-B)。研究表明，低浓度NaNO3氮素处理显著抑制SnRK2.4基因的表达量(P<0.05)，15.0 mmol/L NaNO3>1.5 mmol/L NaNO3>0 mmol/L NaNO3(图7-C)。由7-D可知，与适磷组(1.0 mmol/L KH2PO4)相比，草地早熟禾SnRK2.4积极响应无磷环境(0 mmol/L KH2PO4)，其中0 mmol/L KH2PO4处理组的表达量是1.0 mmol/L KH2PO4的4.49倍。本研究结果表明，ABA、BR浓度及处理时间均显著影响SnRK2.4的表达。SnRK2.4的相对表达量随着5mg/L ABA诱导天数的增加显著上调，即21 d>7 d>0 d，但随15 mg/L ABA诱导天数的增加，SnRK2.4基因呈现先增加后降低的趋势，7 d>21 d>0 d(图7-E)。由图7-F 可知，0.1 mg/L 及1.0 mg/L BR诱导期间，SnRK2.4相对表达量均呈现先降低后上升的趋势，21 d>0 d>7 d，可见，高浓度1.0 mg/L BR的诱导更有利于SnRK2.4基因的表达。综上，草地早熟禾SnRK2.4基因可以积极响应干旱、盐、氮、磷、ABA和BR等非生物胁迫。

图5 草地早熟禾SnRK2.4蛋白质的二级、三级结构Fig.5 Secondary and tertiary structure of SnRK2.4 protein in kentucky bluegrass

不同小写字母表示组织部位中基因表达差异显著 (P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant differences among tissue(P<0.05).

3 结论与讨论

本研究利用RT-PCR方法克隆获得草地早熟禾蛋白激酶SnRK2.4基因，其开放阅读框与二穗短柄草、大麦的SnRK2.4高度同源。与SnRK3家族成员相比，SnRK2包含的成员数量较少，有报道水稻、大麦、二穗短柄草等禾本科的SnRK2家族大多数包含10个成员，SnRK2s主要具有一个ATP结合位点和一个Ser/Thr激酶结构域，这与本研究结果一致[11-12]。草地早熟禾SnRK2.4蛋白生物活性位点包含酪氨酸激酶磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-肉豆蔻酰化位点、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点、cAMP 和 cGMP 依赖性蛋白激酶磷酸化位点等，这与二穗短柄草、大麦、长穗燕麦草分析结果一致，但富含谷氨酸的区域在二穗短柄草未发现，可见禾本科植物中SnRK2蛋白激酶成员结构有一定差异。SnRK2是植物特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，其多种磷酸化位点在逆境胁迫过程中的信号转导机制起重要作用[13]。研究发现，N-肉豆蔻酰化作用位点是植物抵抗逆境环境时调节膜靶向和信号转导的重要区域[14]。cAMP 依赖性蛋白激酶 (PKA)或 cGMP 依赖性蛋白激酶 (PKG)的激活促进蛋白酶体功能[15]。

研究发现，二穗短柄草BdSnRK2.4积极响应干旱、NaCl胁迫，随着PEG处理时间的增加，BdSnRK2.4相对表达量显著上调，NaCl处理组的相对表达量均显著高于未处理组[10]，这均与本研究结果一致。McLoughlin等[16]研究发现，拟南芥SnRK2.4 和SnRK2.10 是拟南芥根中盐胁迫下活化最快的蛋白激酶之一。另外，盐胁迫下拟南芥SnRK2.4 和 SnRK2.10可以参与调节 ROS 动态平衡[7]。可见，SnRK2.4 可作为植物盐胁迫适应的调节因子发挥一定作用。Lou等[17]研究发现，在水稻OsSnRK2.2可以调节硝酸盐相关转运体NRT1.1进而促进硝酸盐的吸收与同化。Su等[18]研究发现，缺氮条件下多个拟南芥SnRK2s家族成员参与ABA 信号调节生长。本研究中，无氮、低氮环境抑制草地早熟禾SnRK2.4基因的表达，但是无磷环境中促进该基因的表达，可见营养环境显著影响草地早熟禾SnRK2.4的表达水平。Joo等[19]研究发现，OsbZIP42是一个ABA信号传导和干旱胁迫耐受性的重要的正调节因子，OsbZIP42 的激活主要依赖于OsSnRK2.4。研究发现，过表达小麦TaSnRK2.4基因可显著提高拟南芥的抗旱、抗盐能力[20]，TaSnRK2.4具有改善千粒质量和应对非生物胁迫的潜力[21]。姜花(Hedychiumcoronarium)在ABA、IAA处理下HcSnRK2.2、HcSnRK2.4和HcSnRK2.9基因的相对表达量显著增加[22]。ABA、ETH处理显著影响多个二穗短柄草BdSnRK2家族成员，如BdSnRK2.2、BdSnRK2.4，玉米(ZeamaysL.)ZmSnRK2.4也可以被ABA诱导激活[9，23]，本研究也得到相似结果。草地早熟禾蛋白激酶SnRK2.4基因克隆与非生物胁迫下表达分析有利于进一步验证该基因的功能。综上，草地早熟禾SnRK2.4积极响应非生物胁迫，这为丰富SnRK2家族在逆境胁迫中的作用和潜在应用有价值提供理论基础。