安中汤对肝胃不和型功能性消化不良大鼠胃肠功能的影响

严子兴，林晓英，刘幼妹，王 雯，林振文，查晓晶，林蔚然

（1.福建中医药大学附属福州中医院，福建 福州 350001；2.中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院，福建 福州 350025）

目前功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）发病机制尚不明确，多认为脑肠轴在其发病中起重要作用［1-3］，其中以 C 型钠尿肽（C-type natriuretic peptide，CNP）-膜结合型鸟苷酸环化酶（particulate guanylyl cyclase，pGC）-环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）通路最为重要，已有研究证实CNP-pGC-cGMP 信号通路参与调控功能性消化不良大鼠胃肠功能［4-5］。目前现代医学治疗FD 以质子泵抑制剂、抗幽门螺杆菌治疗及促胃动力为主，但疗效欠佳，且容易反复发作，因此寻求更有效的治法势在必行。中医学从整体观入手，对功能性疾病有较好的疗效，在调节胃功能方面积累了丰富的理论和临床经验。安中汤是福建省名老中医唐江山治疗消化道疾病的经验方，临床具有一定疗效，故本研究探讨安中汤治疗肝胃不和型FD 大鼠的疗效及作用机制，为临床应用提供参考依据。因有多项研究表明多潘立酮治疗FD 效果明显，毒副作用较低，故采用多潘立酮治疗作为阳性对照［6-7］。

1 材料和方法

1.1 实验药物 安中汤组成：党参15 g，白术9 g，茯苓 9 g，炙甘草5 g，柴胡6 g，白芍 9 g，枳实 6 g，沉香（后下）3 g，姜半夏5 g，陈皮5 g，百合15 g，乌药10 g，煅瓦楞子15 g。由福建中医药大学附属福州中医院制剂室生产，常规煎煮后将汤药分装为100 mL/袋，含生药量浓度为1.12 g/mL；多潘立酮片（西安杨森制药有限公司，规格：10 mg/片，产品批号：LKJ0277）10 mg 研成细粉以蒸馏水 10 mL 稀释混匀，配制成1 mg/mL 混悬液，冰箱4 ℃保存。以上药液临用前恢复至室温。

1.2 实验动物 健康Wistar 雄性大鼠86 只，体质量（280±20）g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005，饲养于中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院动物中心，许可证号：SYXK（军）2018-0003，饲养在室温18～22 ℃，湿度40%～60%的环境中。普通饲料喂养（各成分热量比例为：碳水化合物60%，蛋白质22%，脂肪10%，包括纤维素在内的其他成分8%），除实验期外自由饮食、饮水，适应性饲养7 d 后进行实验。本实验所有相关动物实验操作都按照中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院动物伦理审查标准严格进行（审批号：2022-008）。

1.3 主要试剂 活性炭末半固体糊：在250 mL 蒸馏水中加入活性炭末2 g，羧甲基纤维素钠10 g，糖8 g，淀粉8 g，奶粉16 g，搅拌均匀［8］，得到约300 mL黑色版固体糊，冰箱4 ℃保存，用时恢复至室温；聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）蛋白定量试剂盒（上海雅酶生物科技有限公司，货号：ZJ101）；大鼠P 物质（SP）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（货号：JM-01851R1）、大鼠胃促生长素（Gherlin）ELISA 试剂盒（货号：JM-10778R1）、大鼠血管活性肠肽（VIP）ELISA 试剂盒（货号：JM-01852R2）、大鼠5-羟色胺（5-HT）ELISA 试剂盒（货号：JM-01849R1）均购自江苏晶美生物科技有限公司；Harris 苏木素（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZLI-9609）；中性树胶（上海华灵康复器械厂，货号：ZLI-9055）。

1.4 主要仪器 蛋白质印迹法（Western blot）转膜仪、Western blot 电泳仪均购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司，Multiskan GO）；紫外分光光度计（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）；高速离心机（Eppendorf AG）；超低温冰箱（Thermo Fisher Scientific）；恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；光学显微镜（奥林巴斯株式会社BX-53 光学显微镜）。

1.5 方法

1.5.1 造模 将86 只Wistar 大鼠先随机选取23 只大鼠作为正常组，剩余大鼠采用郭氏夹尾刺激法［9］建立FD 大鼠模型，该造模方法在肝胃不和型FD 大鼠的制备实验中应用广泛［10］。具体方法如下：使用卵圆钳夹住大鼠尾巴中外1/3 处，每天进行2 次，每天 9：00AM、15：00PM 各夹 1 次，每次夹 30 min，以使大鼠暴躁、反抗或相互攻击、撕咬，尽量不使大鼠的尾部皮肤受到破损，连续造模7 d，造模期间所有大鼠均给予正常饮食及饮水。7 d 后，从正常组23 只大鼠中随机选出3 只，从造模的63 只大鼠中随机选出3 只，禁食不禁水1 d，结果观察到造模组3 只大鼠出现明显毛发杂乱、粪便稀溏、活动量减少、进食量减少、紧张易激等肝胃不和表现。次日9：00AM 以10 mL/kg灌胃活性碳墨半固体糊，30 min后腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉处死，开腹取全胃并结扎贲门及幽门，取小肠并结扎幽门、回盲部，进行胃排空和肠推进率检测，见表1。结果显示造模组胃排空率及小肠推进率均小于正常组，2 组比较差异有统计学意义（P＜0.05）表示造模成功。

表1 2 组大鼠胃排空率与小肠推进率比较（）

表1 2 组大鼠胃排空率与小肠推进率比较（）

注：与正常组比较，1）P＜0.05。

小肠推进率/%92.28±2.86 76.02±2.531）组别正常组造模组n3 3胃排空率/%74.52±5.44 49.45±6.051）

1.5.2 动物分组及给药 造模成功后将造模组60只Wistar 大鼠随机分为安中汤组、多潘立酮组、模型组各20 只。根据人与动物按体表面积折算公式计算，安中汤组予安中汤混悬液 9 mL/（kg·d）、多潘立酮组予多潘立酮混悬液2.7 mL/（kg·d）、模型组和正常组予10 mL/（kg·d）生理盐水分别灌胃，以上液体灌胃时均恢复至室温。4 组均在每日9：00—10：00 AM、15：00—16：00 PM 灌胃，共21 d。

1.5.3 指标检测

1.5.3.1 一般情况观察 造模期间及药物干预期间每日8：00AM、14：00PM 观察各组大鼠毛发的颜色与光泽、大小便的性状、每日的活动度及反应。在适应性喂养后、造模后，药物干预第7、14、21 天的08：00AM 分别对4 组大鼠进行称体质量，灌胃前将大鼠放置电子秤，并记录每只大鼠体质量，本实验只对比灌胃前的体质量变化。

1.5.3.2 血清VIP、Ghrelin、5-HT和SP含量检测 药物干预后，80 只大鼠禁食不禁水1 d，次日9：00AM给予活性碳末半固体糊2 mL 灌胃，30 min 后腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉后立即开腹行腹主动脉采血5 mL，于乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）抗凝管静置，低温离心机以3 500 r/min 离心20 min，取血清后于标本瓶分装保存于-80 ℃液氮中，待检测时将标本盒取出，待温至37 ℃，按照试剂盒步骤采用ELISA 法检测上述指标含量。

1.5.3.3 胃排空率、小肠推进率检测 腹主动脉采血后处死，取全胃并结扎贲门及幽门，取小肠并结扎幽门、回盲部，进行胃排空和肠推进率检测。全胃取出，使用滤纸擦干胃表面水分之后对胃称重为胃全重，然后从胃大弯处切开胃，用清水将胃部冲洗干净，接着使用滤纸吸干胃内外侧表面水分对胃部进行第二次称重为胃净重，后分别计算胃排空率、小肠推进率，具体公式如下：‘

胃排空率＝1－［（胃全重－胃净重）/活性炭末半固体糊］×100%

小肠推进率＝L0/L×100%

注：L 为无张力状态下从幽门至回盲部的长度；L0为无张力状态下从幽门至炭末推进最前沿的长度。

1.5.3.4 大鼠胃窦组织的Ghrelin、CNP 蛋白相对表达量检测 采用Western blot 法检测，取胃窦组织匀浆、裂解后，放入离心管中，4 ℃ 12 000 r/min 条件下离心15 min，取上清液进行蛋白含量测定。根据蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，按照50∶1 的比例混合BCA Reagent 和Cu Reagent 配置工作溶液，在570 mm 的波长条件下对CD 值进行检测，根据测定结果绘制出CD 值与蛋白浓度之间的关系曲线，后进行蛋白质样本变性。SDS-PAGE 凝胶电泳：将2 组蛋白转移至PVDF 膜转膜后，取PVDF 膜置于封闭液中1 h；根据目的蛋白的位置将PVDF 膜切成条状，将试纸条置于蛋白质抗稀释溶液中并在4 ℃下孵育过夜，TBST 薄膜在室温摇洗3×10 min；按照目的蛋白的差异针对性地加入对应的二抗，在室温状态下静置1.5 h，TBST 薄膜在室温摇洗3×10 min；将塑料薄膜放入暗箱内，底部可以通过注水实现薄膜的固定，将PVDF 薄膜静置在薄膜内，保证附着有蛋白质的正面向上，把发光液试剂盒内的2 种不同的液体按照1∶1 的比例进行混合摇匀，并将其滴入薄膜后保证5 min 的反应时间；注意使用塑料镊子捏住PVDF 的一边，在确保发光液顺利流下之后，用保鲜膜盖好，放入机器曝光和拍照，获取目的蛋白的相对表达量。

1.5.3.5 胃窦黏膜组织病理学形态观察 胃窦黏膜组织二甲苯Ⅰ、Ⅱ进行脱蜡，准备盖玻片备用；用酒精进行覆水处理，用自来水反复冲洗3 次；采用苏木素染色，时长5 min；采用浓度为5%乙酸溶液进行1 min 的分化处理后，用自来水进行冲洗，在组织上滴入乙酸并置于载玻片之上；采用HE 染色，按染色状态，适时采用流水进行冲洗；脱水后晾干样本后进行封片，借助吸管吸一滴中性树胶，压片之后应当全覆盖组织；最后用奥林巴斯BX-53 光学显微镜观察胃窦黏膜组织病理学形态。

2 统计学方法

数据采用SPSS 25.0 统计软件进行分析。计量资料符合正态分布以（）表示，组内比较采用重复测量方差分析，两组间比较采用t检验，多组间比较符合正态分布采用单因素方差分析，采用最小显著性差异法（LSD 法）。P＜0.05 表示有统计学意义。

3 结 果

3.1 一般情况 与正常组比较，模型组大鼠出现毛发杂乱、粪便稀溏、活动量减少、紧张易激等表现，药物干预组的大鼠一般情况较模型组有所改善；从各组大鼠实验各阶段体质量变化可看出，安中汤组及多潘立酮组大鼠灌胃第7 天的体质量增长幅度高于模型组大鼠（P均＜0.05），其数值及增长幅度接近正常组，安中汤组大鼠的体质量增长幅度略高于多潘立酮组。见表2。

表2 4 组大鼠实验各阶段体质量比较（） g

表2 4 组大鼠实验各阶段体质量比较（） g

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

灌胃21天341.70±4.16 320.25±4.591）335.30±3.332）336.75±2.992）组别正常组模型组多潘立酮组安中汤组n 20 20 20 20适应性喂养后300.65±3.13 301.75±4.21 302.70±4.67 302.65±2.70造模后320.40±3.25 312.45±4.571）313.25±4.471）313.80±2.841）灌胃第7天325.95±3.89 314.90±4.101）320.20±3.692）321.25±2.152）灌胃第14天333.05±4.03 318.00±4.411）327.15±3.122）328.45±2.042）

3.2 4 组大鼠血清 Ghrelin、VIP、SP、5-HT 水平比较 见表3。

表3 4 组大鼠血清Ghrelin、VIP、SP、5-HT 水平比较（） pg/mL

表3 4 组大鼠血清Ghrelin、VIP、SP、5-HT 水平比较（） pg/mL

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

5-HT 14.77±0.50 26.10±0.241）14.99±0.262）16.76±1.072）组别正常组模型组多潘立酮组安中汤组n 20 20 20 20 Gherlin（pg/mL）782.80±13.10 562.50±11.051）749.70±16.412）817.60±17.062）VIP 111.90±2.44 218.40±4.821）168.70±4.162）127.50±6.482）SP 3.13±0.15 5.40±0.151）3.85±0.132）3.21±0.112）

3.3 4组大鼠胃排空率和小肠推进率比较 见表4。

表4 4 组大鼠胃排空率及小肠推进率比较（）

表4 4 组大鼠胃排空率及小肠推进率比较（）

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

小肠推进率/%94.04±0.41 77.82±1.201）89.21±0.582）89.16±0.402）组别正常组模型组多潘立酮组安中汤组n 20 20 20 20胃排空率/%76.34±1.29 49.49±1.041）74.31±0.922）71.79±0.542）

3.4 各组大鼠胃窦Ghrelin、CNP 蛋白相对表达量比较 与正常组比较，模型组大鼠胃窦组织中CNP 蛋白相对表达量明显提高，Ghrelin 蛋白相对表达量明显下降（P＜0.05）；与模型组比较，安中汤组与多潘立酮组大鼠胃窦组织中CNP蛋白相对表达量明显降低，Ghrelin蛋白相对表达量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；各组β-actin 蛋白相对表达量未发现明显差异。见图1、表5。

表5 4组大鼠胃窦组织CNP、Ghrelin蛋白相对表达量比较（）

表5 4组大鼠胃窦组织CNP、Ghrelin蛋白相对表达量比较（）

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

组别正常组模型组多潘立酮组安中汤组Ghrelin 31 303.00±111.30 13 640.00±67.651）38 446.00±242.402）28 323.00±197.802）CNP 22 834.00±475.50 38 868.00±716.001）27 072.00±580.002）27 206.00±635.302）

图1 Western blot检测4组大鼠胃窦组织Ghrelin、CNP蛋白相对表达量

3.5 各组大鼠胃窦黏膜HE 染色组织病理学形态比较 正常组镜下有少量淋巴细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞，腺体排列规则；模型组镜下可见大量淋巴细胞、中性粒细胞及少量嗜酸性粒细胞，腺体排列不规则，其余无明显异常；多潘立酮组镜下炎性细胞浸润较模型组减轻，见少量淋巴细胞、中性粒细胞及个别嗜酸性粒细胞，腺体排列尚规则，其余无明显异常；安中汤组镜下无明显炎性细胞浸润，腺体排列规则。见图2。

图2 4 组大鼠胃窦黏膜组织病理学形态HE 染色图（×20）

4 讨 论

胃肠道是一种由多个神经系统所复合主导的器官系统，其中不仅仅有肠神经系统（enteric nervous system，ENS），还包括中枢神经系统（central nervous system，CNS）和植物神经系统（autonomic nervous system，ANS）。肠神经系统可通过内脏敏感性反作用于中枢的痛觉、情绪和行为，其神经系统间的传导失常是导致FD 的重要机制［11］。有研究表明：调节相关脑肠肽水平可以纠正脑、肠内分泌失调，改善FD 症状［12］。调节相关脑肠肽水平主要是通过CNP-pGC-cGMP 信号通路来实现的，CNP存在于中枢神经系统和胃肠道中，是脑-肠轴中具备生物活性的多肽［1，13-16］，对纵向胃平滑肌有松弛作用［17］。在平滑肌中，CNP 与受体 NPR-B 特异性结合，激活 pGC［3，18］，从而致三磷酸鸟苷的环化，成为cGMP。cGMP 作为第二信使存在于人体之中，能够使平滑肌产生舒张现象，促进胃排空，最终影响胃肠道功能［19］。已有研究证实FD 大鼠胃肠功能的改变与 CNP-pGC-cGMP 信号通路的表达相关［4］。此前，已有诸多研究证实FD 的发病由多种脑肠肽共同参与，如5-HT、Ghrelin、VIP、SP 等。

本研究结果显示：与正常组比较，模型组大鼠血清 Ghrelin 明显降低，5-HT、VIP、SP 明显升高。有报道指出，情绪可以影响脑肠轴的功能，其分泌功能的失调使5-HT 水平上升，导致胃肠道敏感性增加［20］。胃动力不足的 FD 患者其 Ghrelin 较正常水平显著下降，这一结果可能与FD 患者进食后胃排空障碍存在一定相关性。VIP 是一类对胃肠运动有抑制，具有神经递质和神经调质双重作用的神经肽，在CNS、胃肠道中大量表达，具有抑制胃肠运动及胃排空、减慢小肠运动、降低消化系括约肌的紧张性、扩血管、减少胃酸和GAS 分泌、促进胰液分泌及抑制胆囊收缩等作用，表明FD 大鼠症状的发生与VIP 升高具有相关性［21］。目前已有研究证实，FD 模型组大鼠或者小鼠的VIP 含量通常会高于正常对照组［22］。研究表明通过降低SP 在血浆中的浓度能够抑制背角神经兴奋，通过降低内脏敏感度，使得FD 模型大鼠肠道过敏现象得到改善［23］。离体细胞实验证明SP 能够增强肠上皮细胞对水和电解质的通透性［24］。本研究结果还显示：安中汤组胃排空率、小肠推进率较模型组明显改善，可知安中汤主要是通过改善大鼠的胃肠动力而起到明显治疗效果。且安中汤组较模型组胃窦CNP 蛋白的表达降低，CNP 对胃窦平滑肌具有明显松弛作用，影响胃的收缩消化功能，安中汤可通过降低CNP 蛋白的表达促进胃肠动力。安中汤组大鼠Ghrelin 蛋白较模型组显著增高，Ghrelin 蛋白具有刺激FD 患者食欲、促进进食、参与胃酸分泌、改善胃肠动力等作用，可见安中汤的治疗机制可能与以上胃肠激素水平变化相关。

中枢神经系统、胃肠道可以通过脑肠轴实现双向调节，这种中枢和胃肠道双向调节的形态在中医中已有叙述，情志失调引起气机紊乱，表现出脏器不能正常行使其功能，而久病和疼痛不适本身也是正气衰弱、加剧情志不畅的因素。在治法上，注重肝主疏泄对情志的调畅尤为重要，肝木盛或中焦之土亏虚都易形成木克土的局面，加重肝胃不和的症状。说明疏肝和胃法在治疗情志为发病重要因素的脾胃疾病中起重要作用，与现代医学从脑肠轴水平整体调节胃肠道功能有共通之处。而本研究选用的安中汤是根据福建省名老中医唐江山长期治疗脾胃病的验方，以六君子汤合百合汤、四磨汤、四逆散加减化裁而成，有平肝制酸、行气止痛之效，护正祛邪，调和气机，行气而不耗气。

综上，安中汤可通过调节Ghrelin、VIP、SP、5-HT及CNP-pGC-cGMP 信号转导通路来调节胃肠运动，促进胃排空与肠道蠕动，改善FD 症状。