石斛合剂对糖尿病大鼠糖脂代谢及其相关通路的影响

林心君，胡海霞，何昱霖，秦崇涛 ，施 红*

（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122）

糖尿病已成为全球广泛关注的公共健康问题，截至2019 年，全球糖尿病患者人数已达4.63 亿，据估算，到2045 年糖尿病患病率将上升至12.2%，其中2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）约占所有糖尿病病例的90%［1］。糖尿病是以高血糖为主要特征的代谢性疾病，与中医“消渴”“脾瘅”等病证相类［2］。本课题组经过多年临床-基础的反复实践，探索形成的中药复方石斛合剂（石斛合剂1 号方和石斛合剂2 号方）已获国家发明专利（专利号：ZL201110408411.0），是福建省第二人民医院院内制剂（批准文号：闽药制字Z 20120006）。课题组前期研究显示：石斛合剂能明显缓解糖尿病患者口干、乏力、燥热等症状，具有稳定的降糖调脂、改善肝功能等作用，还能改善糖尿病模型大鼠的糖脂代谢，促进胰岛细胞增殖和胰岛素受体表达，抑制肝脏和肾脏纤维化［3-6］。糖尿病及其并发症的发生机制复杂，并发症更是累及机体多器官、多系统，用相对和绝对定量同位素标记（iTRAQ）技术筛选糖尿病差异蛋白已成为糖尿病诊疗研究的新热点之一［7］。故课题组应用石斛合剂治疗糖尿病大鼠，提取大鼠肝组织蛋白，以iTRAQ 技术鉴定并分析各组大鼠的差异蛋白质，继而进行代谢通路富集分析，探讨石斛合剂对糖尿病大鼠糖脂代谢相关通路的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF 级 Wistar 大鼠 40 只，体质量（200±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2012-0002。饲养于福建中医药大学实验动物中心，单笼5 只饲养，自由取食和饮水，12 h 光照/12 h 黑暗，室温 25 ℃，相对湿度60%～70%。基础饲料由动物实验中心提供，高脂饲料配方为60.7%基础饲料、15%蔗糖、10%猪油、10%蛋黄粉、4%胆固醇和0.3%胆酸盐。

1.2 实验药物 石斛合剂1 号方（黄芪20 g，石斛15 g，知母10 g，葛根 15 g，五味子 8 g，生地黄 15 g，丹参15 g，黄连6 g，地龙9 g）、石斛合剂 2 号方（茵陈18 g，滑石 15 g，扁蓄15 g，栀子10 g，车前子10 g，大黄3 g）购自福建中医药大学国医堂，用水分别浸泡上述 2 方药材 30 min，然后采用水提醇沉法［5］制备成含生药量2 g/mL 的药液，将药液按每瓶100 mL分装，密封保存在-20 ℃冰箱，待用时水浴加热。二甲双胍片（中美上海施贵宝制药有限公司，产品批号：1302094）用蒸馏水稀释至含药量5 g/L，每瓶100 mL 分装。

1.3 主要试剂与仪器 链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司，货号：WXBB2432）；质谱级胰蛋白酶Trypsin（美国 Thermo Scientific 公司，货号：90057）；iTRAQ试剂（美国SCIEX 公司，货号：4381664）；Triple TOF 5600 质谱仪器（美国SCIEX 公司，型号：AB SCIEX，Concord，ON）；纳升液相色谱仪（日本岛津公司，型号：LC-20AD）。

2 实验方法

2.1 造模、干预和取材 40 只Wistar 大鼠适应性喂养1 周，随机抽取10 只大鼠作为正常组，予普通饲料喂养；剩余30 只为造模组，予高脂高糖饲料喂养 6 周后，腹腔注射 STZ（每次 25 mg/kg，连续 2 次，时间间隔3 d）加以诱导［8］。第2 次腹腔注射STZ 72 h 后尾静脉采血，用快速血糖仪检测血糖，以随机血糖＞16.7 mmol/L 判定造模成功（本研究中造模组大鼠全部成模）。造模组按随机数字表法分为模型组、石斛合剂组、二甲双胍组，每组10 只。石斛合剂组先以石斛合剂 1 号方按 8.6 mL/（kg·d）灌胃7 d，继以石斛合剂2 号方按6.2 mL/（kg·d）灌胃3 d，如此循环灌胃60 d；二甲双胍组以二甲双胍溶液10 mL/（kg·d）灌胃，药物剂量均按 60 kg 成人临床等效剂量进行干预；模型组、正常组按10 mL/（kg·d）生理盐水灌胃，连续60 d。

2.2 血糖血脂检测 灌胃结束，禁食12 h，腹腔注射10%乌拉坦麻醉，迅速开腹，抽取各组大鼠腹主动脉血，采用全自动生化仪分析空腹血糖（FBG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）。断头处死大鼠后每组随机取3 只大鼠肝组织置于液氮中储存以行蛋白组学检测。

2.3 肝组织差异蛋白质代谢通路富集分析 ①从肝组织提取蛋白，对提取后的蛋白进行还原烷基化处理，打开二硫键以便后续步骤充分酶解蛋白。② 取出上述蛋白100 μg，按蛋白∶酶＝20∶1 加入胰蛋白酶Trypsin 酶解。③Bradford 法计算出蛋白浓度。④按照iTRAQ 试剂盒说明书，采用iTRAQ 技术标记每一组肽段，室温培养2 h；将标记后的肽段进行等量混合，混合后的肽段使用强阳离子交换色谱进行预分离；最后进行液相串联质谱（LC-MS/MS）分析［9］。⑤ 选择数据库 IPI（International Protein Index）Rat（39925 sequences）［10］，用蛋白质鉴定软件Mascot 2.3.02（检索参数设置见表1）搜索数据库，进行基于质谱数据的肽段及蛋白质鉴定；比较各蛋白在不同组间的相对含量，当蛋白丰度差异倍数达到1.2 倍以上，且P＜0.05 时视为差异蛋白；通过富集分析确定差异蛋白质参与的主要代谢途径和信号转导途径。

表1 检索参数设置

2.4 统计学处理 采用SPSS 22.0 进行统计分析。计量资料属正态分布以（）表示，组间比较采用单因素方差分析（LSD 或Games-Howell）。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 4 组大鼠FBG、TC、TG 水平比较 见表2。

表2 4 组大鼠 FBG、TC、TG 水平比较（） mmol/L

表2 4 组大鼠 FBG、TC、TG 水平比较（） mmol/L

注：与正常组比较，1）P＜0.01，2）P＜0.05；与模型组比较，3）P＜0.01，4）P＜0.05。

TG 0.64±0.10 0.91±0.282）0.69±0.114）0.82±0.08组别正常组模型组石斛合剂组二甲双胍组n 10 10 10 10 FBG 5.43±0.46 16.89±1.291）6.99±1.073）6.38±0.913）TC 1.75±0.09 2.05±0.212）1.82±0.104）1.75±0.114）

3.2 肝组织差异蛋白代谢通路富集分析结果 肝组织蛋白共鉴定出iTRAQ 标记的肽段所代表的蛋白3 631 个，其中石斛合剂组/模型组的肝组织差异蛋白为352 种［9］；按差异蛋白在信号通路中的贡献度（即该差异蛋白占该信号通路总蛋白数的百分比）从高到低排序，石斛合剂组/模型组肝组织差异蛋白代谢通路富集分析结果见表3。

表3 石斛合剂组/模型组的肝组织差异蛋白代谢通路富集分析（n，%）

4 讨 论

4.1 石斛合剂对糖尿病模型大鼠糖脂代谢的影响 本研究采用高糖高脂饲料加STZ 注射诱发的动物模型，接近人类T2DM 的发病过程［8］。本实验结果显示：模型组大鼠FBG 显著高于正常组，且在实验期间FBG 均＞11.1 mmol/L，说明模型稳定性好；治疗后石斛合剂组、二甲双胍组FBG 均明显降低，说明石斛合剂有确切的降血糖作用；与正常组比较，模型组TC、TG 有显著上升，说明模型大鼠存在脂代谢紊乱，高脂血症是产生胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）、炎症反应等代谢障碍的关键因素［11-12］；石斛合剂治疗后TC、TG 相较模型组下降显著，说明石斛合剂能纠正糖尿病模型大鼠血脂代谢紊乱；二甲双胍组TC 也有显著下降，而TG 虽有下降趋势，但差异无统计学意义。综上，石斛合剂能改善糖尿病大鼠的糖脂代谢，减少糖脂毒性的损伤，这与课题组前期研究结果一致。

4.2 肝组织差异蛋白代谢通路分析 在肝脏糖异生与糖酵解共同作用，使机体葡萄糖维持在一定的浓度，若糖异生过度可引起机体血糖升高。IR 已成为 T2DM 的主要病理标志［13-14］，而炎症与 IR 关系密切，近年来炎症学说在T2DM 发病机制的研究中备受关注。作为核转录因子之一的核因子κB（NF-κB）可被高血糖激活，通过多种途径导致细胞和组织炎症，不仅干扰胰岛素分泌，还能通过抑制胰岛素信号通路中的关键因子导致IR 的发生［15］。本研究结果显示石斛合剂组/模型组的肝组织差异蛋白涉及糖异生/糖酵解通路、胰岛素信号通路、NF-κB通路，故石斛合剂可能通过上述多条信号通路改善糖尿病大鼠的糖脂代谢。

生糖氨基酸可通过糖异生转化成葡萄糖，其代谢异常会导致机体糖异生异常［16］。研究发现在亮氨酸缺乏条件下，肝脏胰岛素的灵敏度增高［17］；而当异亮氨酸和缬氨酸缺乏时，小鼠出现脂肪组织产热以及分解增加，而出现消瘦［18］。提示亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸信号通路障碍可导致糖异生失常［19］。此外精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸代谢异常等均可诱发或加重糖尿病，其中甘氨酸的降低与游离脂肪酸（FFA）的增加有关，并与T2DM 的发生呈负相关，色氨酸在糖尿病患者的血浆中升高，与T2DM 发病率呈显著的正相关［20-21］。本研究结果显示石斛合剂可能通过上述氨基酸信号通路调节糖异生，改善糖脂代谢。

糖尿病脂毒性学说认为：异常的脂代谢可造成胰岛素敏感组织（肝脏、脂肪和骨骼肌）中异常的脂沉积并导致IR。脂肪细胞分泌的多种炎症因子可引起β 细胞凋亡和 IR，诱发或加重T2DM［22］。有研究表明饱和脂肪酸与DM 患病风险呈正相关［23］。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）包括α、β、γ 3 种表型，其中PPARα 是调控脂肪细胞分化的重要因子，而PPARγ 除了能调节脂代谢，还有抗肝纤维化的作用［24］。本研究结果显示石斛合剂可能通过脂肪酸代谢通路和PPAR 通路调节糖尿病大鼠的脂代谢。

糖代谢产生的碳骨架、蛋白质分解产生的氨基酸以及甘油都可进入三羧酸循环（TCA）氧化，因此TCA 是糖类、脂肪和蛋白质代谢的共同通路。这三大物质都可转化成丙酮酸，并通过中间产物乙酰辅酶A 进入三羧酸循环，释放出大量的ATP 为机体各项生理过程供能。与能量代谢有关的柠檬酸是TCA 的起始步骤，柠檬酸信号通路传导异常直接导致TCA 出现异常。氧化磷酸化是合成ATP 的主要途径，该信号通路传导异常则诱发线粒体损伤及细胞凋亡。本研究结果显示石斛合剂可能通过淀粉与蔗糖的代谢、柠檬酸代谢、丙酮酸代谢和氧化磷酸化通路调节糖尿病大鼠的糖脂代谢。

本研究中差异蛋白所涉及的多条信号通路都与糖尿病糖脂代谢紊乱相关，这为石斛合剂防治糖尿病及其并发症的研究提供了新的思路和方法。