核磁共振光谱和质谱在代谢组学中的优势和劣势

李名悦, 林向成, 赵萌萌

(桂林电子科技大学 材料科学与工程学院,广西 桂林 541004)

代谢组学研究是一种技术驱动的方法,分析工具、软件和统计数据分析的最新发展推动了该领域的发展。核磁共振光谱(nuclear magnetic resonance spectroscopy,简称NMR)和质谱(mass spectrometry,简称MS)是代谢组学研究中最常见的分析工具[1-9]。NMR技术的高重现性以及MS技术的高灵敏度和选择性意味着这些工具优于其他分析技术。代谢组学研究可以分为靶向或非靶向分析类别。非靶向分析侧重于样品中代谢物总补体(“指纹”)的代谢分析。NMR 常用于代谢组学指纹研究。靶向代谢组学方法侧重于对选定代谢物的定量和鉴定,例如参与特定代谢途径的代谢物或其他作为给药摄入的直接产物的代谢物。在靶向分析中,所研究的代谢物通常是已知的,可以调整样品的制备,以减少相关代谢物的干扰影响。基于MS的代谢组学方法通常是靶向分析的最佳方法。

MS方法和机器的不断发展为代谢组学提供了一种高度特异性的分析工具,可提供未知物质的化学信息,例如用于确定元素分子式的相对分子质量质量、同位素分布模式、通过母离子和碎片离子的特征进行结构解析、使用与真实化合物数据的光谱匹配,以及混合样品中不同化学物质浓度水平进行比较。事实上,基于MS的代谢组学技术由于其较高的灵敏度和较好选择性,为众多的代谢组学研究提供了一个强大的平台。与NMR光谱相比,MS在分析代谢物方面具有优势,检测水平的灵敏度有了很大提高[10-11]。此外,不同的MS技术提供了可以应用的操作原理,例如不同的电离技术,因此增加了可能检测到的代谢物的数量。

1 材料

核磁共振光谱的高重复性以及非破坏性特征是NMR在代谢组学研究中的重要优势。此外,NMR可用于体内研究,称为磁共振光谱(MR spectroscopy,简称MRS),任何通过NMR光谱研究的体外代谢物途径都可以通过使用MRS的体内研究来进行。基于NMR代谢组学方法包括同位素标记的原子核,例如13C和15N,可用于获取有关生物系统中代谢物平衡的有用信息,并监测化合物通过代谢途径的流动。在短短几分钟内就可以同时检测到大量代谢物,这说明了核磁共振光谱在代谢组学研究中的进一步优势。例如,单个质子NMR光谱可以量化人体尿液样本中的约100种代谢物,从而提供给定时间点的人体代谢状态[12]。此外,高分辨率魔角旋转(high-resolution magic-angle spinning,简称HRMAS)NMR光谱可用于研究完整的组织样本,从而无需预先准备步骤(如提取)即可检测组织中存在的代谢物。图1显示了过去12年中基于NMR和基于MS的代谢组学出版物数量的增加。

图1 NMR代谢组学和MS代谢组学出版物的数量

总之,一个单一的分析平台是不能够对样品中的所有分子进行完整的定量和识别。表1展示了核磁共振光谱与质谱相比的优势和局限性。因此,除了一维和二维NMR实验外,还需要采用不同的技术,例如不同的电离方法与液相色谱-质谱(简称LC-MS)和气相色谱-质谱(简称GC-MS)相结合,可以最大限度地识别复杂样品中不同代谢物的阳离子。例如,Wishart等采用不同的分析平台,如NMR、GC-MS、直接流动注射质谱(DFI/LC-MS/MS)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和高效液相色谱(HPLC)来鉴定人类尿液代谢物。结果表明,除了179种GC-MS、127 种DFI/LC-MS/MS、40 种ICP-MS 和10 种HPLC外,共有209种不同的代谢物可通过NMR进行鉴定。本文重点介绍了NMR 和MS作为适用于代谢组学研究的工具的优势和劣势。

表1 核磁共振光谱和质谱的优点和局限性

与MS相比,NMR光谱需要高技能和训练有素的操作人员,购买和维护成本更高;它还需要很大的仪器空间。因此,与NMR 光谱仪相比,MS器在临床中心和医院中更为常见。

2 方法

核磁共振光谱是一种功能强大的分析工具,主要用于化学鉴定和定量给定样品的化学成分。NMR的应用不仅限于液体样品,还可以用于固体[12]、气相[13]和组织样品[14]。此外,除了在分子鉴定和结构解析方面的主要应用外,核磁共振光谱还可用于研究分子的物理和化学性质,如电子密度和分子动力学[15-17]。因此,核磁共振已成为结构生物学研究的主要工具,因为它使研究人员能够研究分子结构以及生物条件下的分子动力学。此外,核磁共振光谱已被广泛用于众多研究领域,包括结构生物学、有机化学、无机化学、生物化学、物理学、生物学、聚合物和药物发现。NMR已被认为是代谢组学应用中最重要的方法之一,例如,作为一种强大的人类疾病诊断方法。低灵敏度是核磁共振在生物医学研究中的固有缺点和首要挑战。随着仪器的不断发展,例如更高的磁场强度、低温冷却探针和微探针[18-19],大大提高了NMR的灵敏度。动态核极化(DNP)方法是最有效的发展之一,已成功用于提高成像和NMR 灵敏度[20-23]。

2.1 核磁共振光谱

2.1.1 高分辨率魔角旋转核磁共振光谱

核磁共振光谱的应用不仅限于液体和固体样品,而且可以通过使用高分辨率魔角旋转(HRMAS)核磁共振光谱扩展到完整的组织样品。通过以54.74°的角度(即“魔角”)旋转样品到磁场,并高速旋转,可以获得与溶液状态NMR 光谱分辨率相当的光谱。使用这种方法可以自发检测组织样本的化学成分,而无需提取等预处理步骤。在基于NMR 的代谢组学方法中,该技术有助于提供生物流体的代谢分析与特定组织的组织学之间的相关性。因此,HRMASNMR光谱已被用于研究小型完整组织样本的代谢组学平衡,包括脑[24]、肾脏[25]、肝脏[26]和睾丸组织。HRMAS最近被用于脑膜瘤活检,作为区分典型脑膜瘤和良性组织的潜在诊断工具。最近,赵英兰及其同事将HRMAS光谱技术与主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)相结合,并用判别分析法(OPLS-DA)对127例患者的直肠癌组织的代谢特性进行了研究,与47例健康对照者的样本进行了比较。结果显示,来自患者的样本和来自健康对照受试者的样本之间存在明显的区别。研究人员发现了几种不同的代谢物,与直肠癌组织的不同阶段相关,因此证明了使用代谢物生物标记物跟踪直肠癌进展的可能性。此外,研究人员共成功鉴定出38种差异代谢物,其中16种被发现与直肠癌的特定阶段密切相关。结果表明,与健康对照样本相比,研究人员发现患者癌症组织样本中乳酸、苏氨酸、醋酸盐、谷胱甘肽、尿嘧啶、琥珀酸盐、丝氨酸、甲酸盐、赖氨酸和酪氨酸等几种代谢物的浓度水平升高,而其他代谢物如牛磺酸、肌酸、甜菜碱、肌醇、磷酸肌酸和二甲基甘氨酸的水平降低。

2.1.2 一维核磁共振光谱

核磁共振光谱已被用于许多具有不同可探测核的多维实验,其中一维质子(1H)NMR实验是最重要的技术,尤其是在代谢组学研究方面。然而,由于化学位移范围很窄(5 000 Hz),重叠信号的1HNMR光谱通常持续存在,这导致谱分配的不确定性。其他原子核如碳和氮具有更宽的NMR化学位移,但也有其他缺点。一维磷(31P)NMR 光谱具有一些优点,例如31P核的天然丰度为100%,化学位移范围宽,灵敏度高。因此,31P核磁共振光谱通常用于研究与能量代谢有关的磷脂和代谢物。然而,大多数代谢物不含磷是31PNMR光谱的主要限制。一般来说,一维碳(13C)NMR光谱的谱宽超过100 000 Hz,拥有更宽的谱。13CNMR光谱在分子鉴定和结构解析方面尤其重要。然而,13C核的低天然丰度(1.1%)及低灵敏度限制了该同位素在基于NMR的代谢组学中的应用。研究人员已经开发了不同的NMR 方法来增强13CNMR信号。例如,(DEPT)谱是提高NMR 光谱灵敏度的有力手段,通过这种方法,13C信号强度可以增强4 倍。DEPT-NMR 实验也可用于区分CH2和(CH,CH3),例如,DEPT-135的13c核磁共振谱会产生具有负强度的ch2峰和具有正强度的ch和ch3峰。

15NNMR光谱在结构生物学中非常重要,包括研究蛋白质、RNA和DNA 结构和动力学,以及研究蛋白质-金属配位、蛋白质-蛋白质和蛋白质-配体相互作用。然而,由于15N 的自然丰度低,仅为0.37%且灵敏度低,预计这种方法在代谢组学研究中的用处不大。

2.1.3 二维核磁共振光谱

二维NMR光谱(2DNMR)可用于克服质子一维NMR光谱中重叠共振的问题,与一维方法相比,可以检测和分配更多的代谢物。二维核磁共振光谱基于空间自旋耦合或键耦合,前者主要用于结构解析,后者用于分子识别。通过键相关,核磁共振光谱分为两大类:同核和异核。同核主要是(1H-1H)如相关光谱(COSY)和全相关光谱(TOCSY)[27],异核,如(1H-13C)。在基于核磁共振的代谢组学研究中,同核和异核的核磁共振光谱都被用于信号分离和代谢物分配。其他二维方法,如二维核磁共振光谱和扩散有序光谱(DOSY)[28]已被用于核磁共振的代谢组学研究。COZY和DOSY结合用于研究从肌肉萎缩症小鼠模型中收集的营养不良的心脏组织的代谢变化。单量子相干(HSQC)、异核多量子相关(HMQC)和异核多键相关(HMBC)的异核2D 实验具有很高的分辨率,已被用于代谢物鉴别和鉴定。

虽然2DNMR实验改善了NMR信号的分散性,但由于数据分析中增加的采集时间、数据大小和复杂性,这种方法不经常使用。由于核磁共振仪器的不断发展,以及新的更快的核磁共振信号采集和数据处理方法,因此,2D 技术在代谢组学研究中的应用日益增多。

2.1.4 相关光谱(COSY)

COZY是二维同核相关光谱的一个技术,多年来一直用于分子鉴定和结构解析[29-30]。COZY 已被用于代谢组学研究,实验时间较短,只需几分钟即可运行2D光谱,并提供远比1DNMR 光谱更多的信息。最简单的COZY 脉冲序列由单个90°射频脉冲和演化时间(t1)以及第二个90°脉冲和测量周期(t2)组成。COZY 光谱包括同核(1H-1H)相关光谱,其中2D光谱中的交叉峰通过核对之间的键耦合表示。交叉峰表示通过2个原子核之间的键磁化转移。这为识别由许多分子组成的样品中属于同一分子的峰提供了一个强大的工具,就像生物样品中的代谢物一样。由于键关联仅发生在同一分子内,因此,COZYNMR光谱已广泛用于基于NMR 的代谢组学应用。

2.1.5 异核单量子相关谱(HSQC)

键关联也可用于两种不同类型的原子核(通常为1H,13C或15N)之间的关联,这两种原子核由一个键隔开。例如,1H-13CHSQC光谱协调了质子和相应键合碳的化学位移,因此每对耦合原子只能获得一个交叉峰。因此,HSQC 为信号分配提供了一种特别有用的方法,尤其是重叠质子信号的分配。此外,HSQC光谱可用于分配质子和碳NMR光谱。

2.2 质谱

质谱(MS)是一种强大的技术,主要用于鉴定未知化合物和定量样品中的已知分子[31-33]。至于NMR和X射线[34-35],它还可以用于结构解析和研究材料的化学性质。由于其高灵敏度和选择性,MS为分析混合样品(例如生物样品)中的代谢物提供了一个重要的分析平台。此外,MS可以检测不含质子或碳的离子,例如金属离子。然而,MS方法不能完全检测所有类别的代谢物,因此必须采用一种以上的方法来进行全面的代谢分析。MS仪器的主要组件具有不同的电离源和质量分析器类型,可用于检测不同类别的分子。例如,GC-MS的优点在于高分离效率和可重复的保留时间,这些保留时间可以在不同实验室之间交换,以使用保留指数概念和保留时间作为标记进行数据比较。然而,GC-MS的固有局限性在于它只能检测挥发性化合物或可以衍生为挥发性的化合物。此外,MS无法检测所有代谢物,因为某些代谢物不会通过某些电离方法电离。MS检测器的动态范围仍然只有三到四个数量级,而代谢物浓度的范围通常要大得多,并且没有可以检测所有代谢物的检测器。生物样品代谢验证的一个难度是许多代谢物尚未完全鉴定。例如,在番茄中检测到的869种不同代谢物中,有494种在常见代谢物数据库中未发现。

质谱法可以检测到的代谢物数量和种类取决于电离模式的选择。一种单一的电离方法不能检测所有代谢物类别,例如极性、非极性、中性离子。因此,应独立使用不同的电离方法以最大化检测到代谢物数量。例如,在LC-MS分析中,正离子模式的电喷雾电离(ESI)是最常见的模式,可以有效电离各种中等大小的极性分子,而负离子模式对于某些代谢物类别更强大,例如碳水化合物和有机酸。据报道,大气压化学电离(APCI)和ESI的使用使红细胞代谢组的覆盖率增加了34%。通过使用GC-MS和LC-MS的一套不同的互补方法,在血液样本的靶向分析方法中可以检测多达100～500种代谢物,并且在一次检测中可以检测到约600～1 000种代谢物指纹模式。需要注意的是,LC-MS中的代谢物识别策略与GC-MS中的不同,GC-MS中通常只检测到分子离子,需要额外的MS/MS实验来获得代谢物的身份和结构信息。

2.2.1 液相色谱-质谱(LC-MS)

LC-MS包括2种强大的分析工具:高效液相色谱法(HPLC,又称高压液相色谱法)和质谱法[36-37]。LC-MS作为一种非常强大的分析工具,用于分离、鉴定和量化混合样品中的分子。HPLC技术首先根据不同的物理和化学性质(例如分子大小、电荷、极性和与其他分子的亲和力)分离分子。HPLC由固定相和流动相组成。固定相使用硅胶等材料,根据分子大小在不同程度上减缓分子的运动,从而根据大小差异分离分子。流动相包括含有样品混合物的溶液,并通过固定相(色谱柱)进行分子分离。柱色谱法可用于从混合物中纯化单个化合物。不同的样品需要不同的柱、蛋白质和肽样品,例如,需要的柱与代谢组学研究中典型的小分子样品所需的柱不同。一旦分析物被分离,它们就会通过质谱分析仪,在那里根据质量荷电比进行检测,每条合成线的强度对应于每个分子的相对浓度。

基于其分离和检测多种分子的能力,LC-MS是应用最广泛的质谱技术,尤其是在生物科学领域。LC-MS是一种非常适用于进行大多数代谢物分析研究的工具,可以高灵敏度进行定量获得结构信息。不同的分离方法可用于分离不同类别的代谢物。例如,反相(RP)梯度色谱法一直是LC-MS研究中用于代谢物分析的最常用的分离方法[38-39]。然而,这不是最适合极性分子和离子的方法,其中包括许多重要的代谢物(有机酸或氨基酸)。这些代谢物代表了生化途径中非常重要的成分,它们的评估对于检测关键代谢状态很重要,例如先天性代谢错误和代谢综合征。亲水相互作用色谱(HILIC)是一种替代方法,可用于电离极性代谢物,从而增加检测到的代谢物的范围。为了最大限度地覆盖所分析的代谢物,可以对样品进行两次分析,分别使用RP 和HILIC 或在HILIC 和RP-LC的“正交”组合中使用二维分析的柱切换方法。尽管RP和HILIC的结合使用是许多代谢物的首选电离方法,但这种方法并未涵盖生物样品(如尿液)的整个代谢物极性范围。因此,建议使用其他电离方法,例如正负电喷雾电离(ESI)模式和大气压化学电离(APCI),以最大限度扩大生物样品中不同代谢物的检测范围。考虑到所有这些可能性,需要以八种不同模式(八次单独运行)进行分析,以全面分析代谢物。这些方法的结合使LC-MS在代谢组学中有更多的应用,因此不同的LC-MS方法被应用在靶向和非靶向代谢组学分析。

2.2.2 气相色谱-质谱(GC-MS)

GC-MS是一种分析挥发性分子的新型工具,具有高分辨率和可重复的色谱分离,这些特点使其非常适合分析复杂的代谢混合物[40-42]。GC-MS包括2种强大的分析方法:气相色谱法和质谱法。这些方法提供了最重要的分离方法之一,可用于提供挥发性化合物的定性和定量信息。样品首先经过气相色谱装置,在气相色谱装置中完成混合物中挥发性有机化合物的高分辨率分离。气相色谱装置主要由色谱柱组成,其长度一般在2～60 m,直径在10～30 cm。

不同种类的气相色谱柱,如填充管和毛细管,用于分离不同种类的样品。填充管可由不锈钢、玻璃或熔融石英制成,通常形成线圈,以便在250℃左右的温度下进入烘箱进行高温实验。惰性气体(如氦气)吹入柱中,当样品被插入色谱柱时,它会蒸发,挥发性分子被氦气推过色谱柱。一开始,所有的分子一起运动,但根据分子量和大小,其中某些分子的运动速度比其他分子慢。较小的分子比较大的分子移动得更快,当它们通过色谱柱时,分子继续彼此分离,最终以不同的组分从色谱柱中分离出来,因此提供了一种有效的分离方法。

当分子离开GC色谱柱时,它们会被引入MS单元,在MS单元中使用电离方法(例如电子束)将它们电离。由特定分子形成的离子取决于该分子的性质,当分子离开GC柱时,它们被引入MS单元,在那里使用电子束等电离方法进行电离。由特定分子形成的离子将取决于该分子的性质,电离分子和分子的离子片段都可用于根据质量电荷比在分子水平上区分和识别混合物的成分。此外,可以通过测量峰值的绝对强度来获得混合物成分的定性信息,其中最高峰值代表100%的丰度,并用作其他峰值的参考。因此,GC-MS是分析挥发性代谢物的首选分析工具,并已用于代谢组学研究的不同领域,包括植物代谢组学和先天代谢错误筛查[40,43-44]。GC-MS还提供了高度可重复的片段,因此为代谢物的鉴定提供了有力的工具。GC-MS的其他优点包括高灵敏度和分辨率、低成本以及仪器的易用性。GC-MS分析的主要局限性在于它仅限于挥发性小分子,这意味着这种方法在代谢分析研究中的应用有限。此外,生物样品(例如生物流体)的制备可能是耗时且重复的,这可能导致实验失败。在电离过程中可能会出现其他问题,例如产物形成和降解。此外,在衍生化反应过程中,非挥发性代谢物可以转化为不同形式的衍生物,从而使同一母体代谢物的不同形式同时存在。在分析真实样本(例如在代谢物含量方面具有高度可变性的人尿)时,衍生化可能会根据代谢物的不同特性以不同的转化率发生,因此可能会显着影响重复性和总体结果。为了克服定量不准确等问题,标准化合物可用于衍生标准化合物和数据校正过程。为了生成可重现的质谱和高度可转移的EI-MS谱库,建议使用70 eV 的标准化MS 电子电离能,以便通过质谱库匹配识别化合。

3 结束语

随着强大的应用与方法学的进步,代谢组学领域正在迅速发展。本文涵盖了NMR 和MS/NMR 方法在代谢组学中的应用,特别强调了它们对靶向和非靶向代谢组学的贡献。在过去的几年中,快速、准确、自动化的鉴定和定量技术一直在改进,预计这一趋势将继续下去。对于靶向代谢组学,进一步提高绝对代谢物定量的自动化、速度和准确性至关重要。MS/NMR方法显然将有助于在代谢组学应用研究中对越来越多的代谢物进行定量分析。