基于网络药理学的当归四逆汤“当归-桂枝”治疗痛经的作用机制研究

程 邦 邓晓童 肖杰文 吕丽芳 刘 伟 欧嵩凤 苏志恒

广西医科大学药学院，广西 南宁 530021

痛经(dysmenorrhea)是最常见的妇科症状之一，具体表现为行经前后或月经期所表现出来的下腹部疼痛、坠胀，还会伴有面色苍白、腰酸、呕吐或其他不适[1-2]。根据全国妇女月经生理常数协作组的调查研究显示，我国女性的痛经发生率约为33%，青少年女性痛经的发病率为20%～90%，其中包括15%的人群伴有重度痛经[3]。针对痛经的治疗，目前常用的方法为药物疗法以及补充药物疗法。其中，使用非甾体抗炎药和口服避孕药为治疗痛经的药物疗法，主要通过抑制前列腺素类物质合成来达到镇痛作用[4]。然而，以上药物长期使用所带来的副作用如胃肠道等不良反应[5-6]亦不容忽视。痛经的中医辨证分型在临床中主要包括气滞血瘀型、寒凝血瘀型、湿热瘀阻型、气血虚弱型和肾气亏损型。目前已将不通则痛、不荣则痛作为痛经的基本病机[7]。原发性痛经气血虚弱证是临床较为常见的证型之一，该类患者主要表现为经期或者经后小腹隐隐作痛，月经量少、颜色比较清晰，面色无华，神疲乏力，舌质淡，脉无力。在临床上目前已将益气养血止痛、温经散寒、活血化瘀止痛作为该证型的基本治疗原则，且疗效稳定[8]。

当归四逆汤为中医方剂名，出自《伤寒论》，为温里剂，具有温经散寒，养血通脉之功效，在临床上常用于痛经的治疗与缓解[9]。其由当归、桂枝、芍药、细辛、通草、甘草、大枣七味中药组成，其中桂枝作为君药，有暖脾胃、通血脉、补元阳的作用[10]。当归为臣药，具有调经止痛、补血活血之功效[11]，在治疗经闭痛经、月经不调等妇科疾病方面素有妇科“圣药”的说法[12]，现代研究[13-15]表明其具有抗氧化、镇痛和促进造血功能等药理作用。当归补血养血活血，桂枝温中补虚，二者在临床上常用于痛经的治疗[16-17]，但目前对其治疗痛经的物质基础和作用机制尚未明确。

当归四逆汤在临床上已被用作治疗痛经的常用中药，但细辛作为其中一味臣药，其成分中含有的马兜铃酸具有较强的毒性，在临床使用中更有“细辛不过钱”的说法。因此，本研究以减毒增效，辨证论治为原则，对当归四逆汤中“当归-桂枝”药对治疗痛经的作用机制进行了研究。同时，作为从系统性、整体性角度来研究的中药网络药理学新方法则与中药辨证论治的原则不谋而合[18-19]。网络药理学是基于系统生物学，对生物系统的网络分析而进行多靶点药物分子设计的新学科。其具有系统性、整体性的特点，从宏观水平探讨“药物-靶点-疾病”之间的复杂网络关系，旨在提高新药临床试验的成功率，进而节省药物的研发费用的一门新技术，现已广泛用于中药作用靶点预测及作用机制阐述中[20-22]。本研究采用网络药理学方法分析和预测当归四逆汤中“当归-桂枝”药对治疗痛经的作用机制，旨在为揭示其治疗痛经的作用机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 当归-桂枝药对成分和潜在靶点的获得与疾病靶点的获取 通过中药系统药理学平台(TCMSP)(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索当归和桂枝两味中药的化学成分，设置化合物类药性(drug-likeness，DL)≥0.18，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30% 对当归-桂枝药对的主要化学成分进行筛选。通过Swisstarget Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)数据库查找当归-桂枝药对化学成分的潜在靶点。通过Drug Bank数据库(https://www.drugbank.ca/)查找获得痛经(dysmenorrhea)的相关靶点。

1.2 成分作用靶点与疾病相关靶点共同靶点的获取 通过Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)将当归-桂枝药对的成分作用靶点与痛经的疾病相关靶点取交集筛选得到共同靶点并绘制韦恩图。所筛选得到的共同靶点可认为是当归-桂枝药对治疗痛经的相关作用靶点。

1.3 化合物-疾病靶点网络和蛋白互作网络的构建 通过Cytoscape 3.8.2软件(https://cytoscape.org/)构建化合物-疾病靶点网络关系图，以探究当归-桂枝药对治疗痛经的作用机制。为了阐述靶点蛋白在系统水平之间的相互作用，将“1.4”所述共同靶点基因上传至在线STRING 10.0数据库(https://string-db.org/)，选择研究物种为Homo sapiens，设定打分值为中等置信度0.4，获取蛋白相互作用信息。将蛋白质相互作用信息导入Cytoscape 3.8.2软件以构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络图。

1.4 基因和通路的富集分析 为了进一步阐明中药成分靶点的相关蛋白在基因功能中的相互作用，本研究采用David v6.8数据库(https://david.ncif crf.gov/summary.jsp)对当归-桂枝药对的潜在靶点进行基因本体(GO)功能富集分析。将当归-桂枝药对的潜在靶点基因上传至数据库，选择形式为official gene symbol。本研究选择GO中分子功能(molecular function，MF)、生物过程(biological process，BP)和细胞组成(cellular component，CC)3个板块对相关基因进行功能分析。利用Excel软件对GO功能富集分析中的GO条目绘制条形图。对中药成分相关靶点蛋白在信号通路层面进行映射，采用David v6.8 数据库对当归-桂枝药对的潜在靶点进行KEGG通路富集分析，并利用 Cytoscape 3.8.2 软件对KEGG通路富集分析中的信号通路构建靶点-通路网络。所富集到的通路被认为是治疗疾病相关的主要通路。

2 结果

2.1 当归-桂枝药对活性化合物的筛选 通过TCMSP数据库平台分析，从当归-桂枝药对两个药物中筛选得到9个化合物(详见表1)。其中，有2个化合物来自当归，7个来自桂枝。

表1 药对活性化合物基本信息

2.2 当归-桂枝药对化合物靶点与疾病靶点的交集 通过Drug Bank数据库，从243个痛经相关靶点中筛选出79个疾病相关靶点。将当归-桂枝药对的61个化合物靶点以及痛经相关的79个潜在靶点上传至Venny 2.1.0取交集后得到6个共同靶点，其可视为当归-桂枝药对治疗痛经可能的潜在靶点(图1、表2)。

表2 药对治疗痛经的潜在靶点

图1 药对化合物靶点-疾病靶点韦恩图

2.3 当归-桂枝药对化合物-疾病靶点相互作用网络 当归-桂枝药对化合物-疾病靶点相互作用网络(图2)总共包括了13个节点(7个化合物节点和6个靶点节点)和20条边，其描述了成分-疾病靶点之间的相互作用关系，其中左侧节点表示中药成分，右侧节点表示疾病相关靶点，每条边则表示中药成分与疾病相关靶点之间的作用关系。网络中节点的度值(Degree)代表和各节点相连的路线和条数。根据网络拓扑学属性筛选其度值较大靶点来进行分析，找到连接成分较多起到枢纽作用的节点，可能是当归-桂枝药对化合物中治疗痛经的关键靶点[23]。网络中各成分的平均靶点数为3，则各靶点平均与3个成分产生相互作用，根据节点的度值列出排名前3的关键靶点(表3)。从中药成分的角度，度值最高的β-谷固醇(M358)能与9个靶点蛋白产生相互作用，因此这个成分可能是当归-桂枝药对治疗痛经比较重要的成分。从靶点角度，度值排名前2位的是孕酮受体(PGR)和前列腺素内过氧化合物酶2(PTGS2)，分别能与4个和7个成分产生相互作用。

2.4 当归-桂枝药对疾病相关靶点PPI网络的构建与分析 为了更好地阐述当归-桂枝药对治疗痛经的作用机制，本研究基于蛋白质-蛋白质互作关系(PPI)构建当归-桂枝药对治疗痛经的潜在靶点PPI网络(如表4、图3所示)。PPI网络包含6个节点，14条边，其中节点表示蛋白。其中，度值最高的前列腺素内过氧化合物酶2(PTGS2)可与8个蛋白产生相互作用。紧随其后的雌激素受体(ESR1)和孕酮受体(PGR)则同样分别能与6个蛋白相互作用。

表3 药对化合物-疾病靶点网络关键节点及拓扑信息

图2 化合物-疾病靶点相互作用网络图

表4 药对治疗痛经PPI网络关键节点及拓扑信息

图3 药对与疾相关靶点PPI网络图

2.5 GO功能富集分析 利用DAVID平台，对当归-桂枝药对的6个潜在靶点进行GO功能富集分析，得到40个GO条目。根据错误发现率(false discovery rate，FDR)小于0.05 筛选出4个GO条目(如表5、图4所示)。 其中，生物过程相关的条目有2个，主要涉及一氧化碳生物合成过程的正调控和对雌二醇的反应方面；分子功能相关的条目也有2个，主要涉酶结合和前列腺素-内过氧化物合酶活动方面；细胞组成相关的条目则无。

2.6 KEGG通路富集分析 利用DAVID平台，对当归-桂枝药对的6个潜在靶点进行了KEGG通路富集分析，得5条信号通路(如表6、图5所示)，分别为脂肪细胞中脂肪分解的调节(regulation of lipolysis in adipocytes)、 花生四烯酸的代谢(arachidonic acid metabolism)、 利什曼病(leishmaniasis)、 雌激素信号通路(estrogen signaling pathway)和血清素的神经突触(serotonergic synapse)。这代表了当归-桂枝药对的有效成分可能通过作用于这些通路来达到治疗痛经的目的。

表5 GO功能富集分析(FDR<0.05)

图4 GO条目分布图(FDR<0.05)

图5 靶点-通路网络图

表6 KEGG通路富集分析

3 讨论

文章以减毒增效，辨证论治为原则，基于网络药理学技术研究了当归四逆汤中关键药对当归和桂枝两味中药的活性成分对痛经的作用机制。将当归-桂枝药对的61个化合物靶点以及痛经相关的79个潜在靶点取交集后，共得到6个共同靶点。通过构建当归-桂枝药对化合物-疾病靶点网络，分析了中药成分与疾病靶点之间的相互关系。

3.1 相关靶点和基因作用机制分析 靶点网络中的关键化合物β-谷固醇(Beta-sitosterol)具有明显的抗炎、抗氧化作用，其潜在的关键作用靶点PGR、PTGS1、PTGS2均参与痛经的激素调节相关通路[24-25]。由此推测，β-谷固醇可能在当归-桂枝药对中发挥治疗痛经的关键作用。PTGS2作为前列腺素生物合成过程中的关键酶，可调控机体内前列腺素的水平[26]。Fatemeh H等[27]发现原发性痛经女性在经期时，其前列腺素含量明显高于正常女性的经期。这是因为前列腺素的靶细胞是子宫平滑肌细胞，当前列腺素的合成增加时，可导致子宫收缩增强、子宫血流减少从而诱发疼痛[28]。PGR是介导孕酮(progesterone，P)发挥生理作用的受体，其表达与机体内孕酮的最终效应密切相关[29]。P可抑制前列腺素F2α( PGF2α)的产生，缓解子宫平滑肌痉挛，减缓痛经[30]。张红梅[31]研究发现，当归提取物可显著升高P含量，通过调节P的体内平衡而缓解痛经。因此，可推断当归-桂枝药对对痛经的治疗作用可能与其调控PTGS2和PGR蛋白的表达密切相关。将当归-桂枝药对的相关作用靶点进行PPI网络构建，对网络分析后发现多个关键相关靶点，包括PTGS2、ESR1和PGR等。ESR1与雌激素结合后，可激活血清中的肥大细胞，释放致痛物质从而导致痛经[32]。有研究报道，雌激素含量增加会间接促进PGF2α的合成和释放，导致子宫收缩、血供不足引起痛经[33]。由此推断当归-桂枝药对中的活性成分可能通过调控ESR1的表达从而达到治疗痛经的效果。

3.2 通路富集分析 富集分析结果表明，当归-桂枝药对治疗痛经的基因功能主要体现在一氧化碳生物合成过程的正调控、对雌二醇的反应、酶结合和前列腺素-内过氧化物合酶活动方面。在KEGG通路分析中，共筛选得到6条通路，包括脂肪细胞中脂肪分解的调节、花生四烯酸的代谢、利什曼病、雌激素信号通路和血清素的神经突触等通路。在花生四烯酸代谢通路中，共同基因PTGS1和PTGS2均在花生四烯酸合成前列腺素类物质过程中扮演着关键性限速酶的异构酶的角色。在细胞因子和生长因子等的刺激下，PTGS2的正常转录水平会被迅速诱导上调，从而催化花生四烯酸产生多种前列腺素，进而导致疼痛及炎症反应[34-35]。与此同时，雌激素信号通路可通过雌激素调节前列腺素的生成进而影响痛经的形成。孕激素可促进雌二醇转化为无活性的雌酮，减少前列腺素的生成，降低子宫平滑肌收缩活性，从而缓解原发性经痛[36]。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，对当归四逆汤中的关键药对当归-桂枝多成分、多靶点、多途径的复杂网状关系进行梳理，对其治疗痛经的作用机制进行了探讨，为临床上当归四逆汤和当归-桂枝药对治疗痛经的使用提供科学的理论依据。