橘红痰咳煎膏质量标准提升的研究

简淑仪 乔 莉 周颖仪 刘潇潇

广东省药品检验所，国家药品监督管理局药品快速检验技术重点实验室，广东 广州 510663

橘红痰咳煎膏是由化橘红、蜜百部、茯苓、半夏(制)、白前、甘草、苦杏仁和五味子共八味药组成的复方制剂，其中的化橘红具有化痰止咳、散寒燥湿、健胃利气的功效[1],为方中君药；五味子与化橘红、半夏相伍，防其燥散伤正之虞，苦杏仁降肺气之中兼有宣肺止咳定喘之功[2]，两者均为佐药。橘红痰咳煎膏现行质量标准收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十八册(标准号：WS3-B-3522-98)，检验项目仅包括3个化学鉴别反应、相对密度及煎膏剂项下的检查项目[3]，缺少对处方中药味的定性鉴别方法和君药的定量检测方法，质量标准的可控性较差。张家瑞[4]以柚皮苷为指标性成分，研究建立了处方中化橘红的含量测定方法；宋丽军等[5]则研究建立了处方中茯苓和化橘红的薄层鉴别方法，同样以柚皮苷为指标性成分，对化橘红的含量测定方法作进一步优化。相关研究[6]表明，化橘红含有黄酮、多糖、香豆素、挥发油等多种化学成分，而黄酮类化合物是化橘红的主要有效成分，其中最主要是柚皮苷和野漆树苷，二者含量之和占化橘红黄酮类物质总量的84%以上[7]，已有相关文献研究建立化橘红及其饮片、汤剂中柚皮苷和野漆树苷的含量测定方法[8-11]。为了进一步完善橘红痰咳煎膏的质量标准，本研究在国家药品标准提高科研专题的要求下，采用TLC法对处方中五味子和苦杏仁进行定性鉴别，采用HPLC法对制剂中的柚皮苷和野漆树苷含量进行测定。

1 仪器与材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪为日本岛津LC-20AT，包括CBM-20A、DGU-20A5R、CTO-20AC、SIL-20AC、SPD-M20A和LabSolution工作站；电子分析天平分别为德国Sartorius CP225D十万分之一型和CP224S万分之一型；美国MILLIPORE Milli-Q纯水处理系统；美国必能信M8800H-C型超声波清洗仪。

1.2 试验材料

1.2.1 对照物质 详细信息见表1。

表1 对照物质信息

1.2.2 试剂 硅胶G薄层板购于德国默克公司；色谱纯甲醇购于Honeywell公司；水为超纯水；中性氧化铝购于上海五四化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯，均购于广州化学试剂厂。

1.2.3 样品 市售12批次橘红痰咳煎膏样品，编号S1～S9购于广东化州中药厂制药有限公司，编号S10～S12购于广州白云山和记黄埔中药有限公司。

2 方法与结果

2.1 鉴别

2.1.1 五味子 取本品15 g，加水50 mL，超声使混合均匀，用三氯甲烷振摇提取2次，每次40 mL，离心使分层，合并三氯甲烷提取液，蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，加在中性氧化铝柱(100～200目，4g，内径为1.5 cm，用甲醇预洗)上，用甲醇50 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5 mL使溶解，作为供试品溶液；取五味子对照药材0.25 g，加水50 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液用三氯甲烷振摇提取2次，每次40 mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液；取五味子醇甲对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液；按橘红痰咳煎膏处方和制法制备缺五味子阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成缺五味子阴性样品溶液。吸取供试品溶液和缺五味子阴性样品溶液各10 μL，对照药材溶液和对照品溶液各1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(3∶2∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视。结果供试品色谱中在与对照药材和对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，且阴性样品无干扰，色谱图如图1所示。12批供试品测定结果如图2所示。

2.1.2 苦杏仁 取本品10 g，加水20 mL，超声使混合均匀，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为2 cm，柱高为16 cm)，用水洗脱至无色，弃去水液，再用20%乙醇150 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为供试品溶液；取苦杏仁苷对照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液；按橘红痰咳煎膏处方和制法制备缺苦杏仁阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成缺苦杏仁阴性样品溶液。吸取供试品溶液和缺苦杏仁阴性样品溶液各10 μL、对照品溶液1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)5～10 ℃放置12 h的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.8%磷钼酸的15%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。结果，供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，且阴性样品无干扰，色谱图如图3所示。12批供试品测定结果如图4所示。

2.2 化橘红含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Kromasil 100-5-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相为甲醇-醋酸-水(30∶4.3∶65.7)；流速1.0 mL·min-1；检测波长0～35 min为282 nm(柚皮苷)、35～60 min为337 nm(野漆树苷)；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2.2 混合对照品储备液和系列混合对照品溶液的制备 分别取柚皮苷和野漆树苷对照品适量，精密称定，用甲醇制得混合对照品储备液(每1 mL含柚皮苷475.923 μg和野漆树苷20.227 μg)；精密量取上述混合对照品储备液适量，用甲醇制成每1 mL含柚皮苷和野漆树苷分别为：380.738 μg和16.182 μg、237.962 μg和10.113 μg、142.777 μg和6.068 μg、47.592 μg和2.023 μg、28.555 μg和1.214 μg的系列混合对照品溶液。

2.2.3 混合对照品溶液的制备 分别取柚皮苷和野漆树苷对照品适量，精密称定，用甲醇制得混合对照品溶液(每1 mL含柚皮苷374.595 μg和野漆树苷15.170 μg)。

2.2.4 供试品溶液的制备 取本品0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)15 min，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.5 阴性样品溶液的制备 按橘红痰咳煎膏处方和制法制备缺化橘红阴性样品，取0.5 g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制得缺化橘红阴性样品溶液。

2.2.6 系统适用性及专属性试验 分别取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按拟定方法测定，记录色谱图。结果如图5所示。供试品色谱中，各待测成分与邻峰分离度均大于1.5，理论板数按柚皮苷峰计算大于5000，且缺化橘红阴性样品无干扰，表明该方法专属性良好。

A.对照品；B.供试品；C.缺化橘红阴性样品； 1.柚皮苷；2.野漆树苷图5 含量测定专属性试验液相色谱图

2.2.7 线性关系考察 取混合对照品储备液和系列混合对照品溶液，按拟定方法测定，以进样量(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，结果如表2和图6所示，表明柚皮苷进样量在0.28555～4.75923 μg的范围内、野漆树苷进样量在0.01214～0.20227 μg的范围内与峰面积呈良好的线性关系。

表2 柚皮苷和野漆树苷线性关系考察

图6 柚皮苷和野漆树苷线性关系图

2.2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液，按拟定方法，分别于0 h、10 h、20 h、30.5 h、38 h、48 h、60.5 h进样测定，记录峰面积。结果柚皮苷和野漆树苷峰面积的RSD分别为0.5%和1.3%(n=7)，表明供试品溶液在60.5 h内稳定。

2.2.9 精密度试验 取混合对照品溶液，按拟定方法连续进样6次，记录峰面积。结果柚皮苷和野漆树苷峰面积的RSD均为0.2%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.2.10 重复性试验 取同一批供试品(编号：S7)，按供试品制备方法平行制备6份供试品溶液，按拟定方法测定。结果柚皮苷和野漆树苷的平均含量分别为9.69975 mg·g-1和0.28245 mg·g-1，RSD分别为0.3%和0.7%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.2.11 回收率试验 取已知含量的同一批供试品(编号：S7)0.25 g，共9份，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，分低、中、高3个水平进行加样回收率考察，每个水平各取3份，3个水平加入柚皮苷和野漆树苷混合对照品溶液的浓度分别为0.15442 mg·mL-1和0.00405 mg·mL-1、0.10316 mg·mL-1和0.00256 mg·mL-1、0.05152 mg·mL-1和0.00132 mg·mL-1，加入量均为25 mL，按供试品制备方法分别制成加样回收溶液，按拟定方法测定，记录峰面积并计算回收率，结果见表3，表明该方法准确度良好。

表3 柚皮苷和野漆树苷加样回收试验结果

2.2.12 样品含量测定 取12批样品，依法制备供试品溶液，按拟定方法进行测定，计算样品中柚皮苷和野漆树苷的含量。结果见表4。

表4 样品中柚皮苷和野漆树苷含量测定结果

3 讨论

3.1 定性鉴别

3.1.1 五味子薄层色谱鉴别方法学考察 样品的前处理过程考察过采用D101大孔树脂吸附柱除去杂质，但色谱效果的重现性较差，背景干扰比较严重，易造成阴性有干扰的判断。方法学考察中分别比较了采用不同品牌的薄层板、在不同温湿度下展开的分离效果，结果显示重现性均较好。

3.1.2 苦杏仁薄层色谱鉴别方法学考察 对样品前处理过程中的乙醇洗脱液进行了不同浓度和不同洗脱体积的考察，结果显示采用20%乙醇溶液150 mL洗脱时，色谱主斑点清晰，背景干扰较少，目标成分洗脱完全。方法学考察中分别比较了采用3种不同品牌的薄层板、在不同温湿度下展开的分离效果，结果只有采用德国默克公司的薄层板时，色谱分离度良好，色谱斑点集中且清晰，不同温湿度下的试验结果基本一致。

3.2 定量测定

3.2.1 色谱条件的选择 流动相的选择参考《中国药典》2020年版一部收载的“化橘红”质量标准[12]，对流动相比例进行适当调整。采用二极管阵列检测器对混合对照品溶液在190～500 nm波长范围内进行扫描，确定柚皮苷和野漆树苷的最大吸收波长分别为282 nm和337 nm，因此采用该两个波长作为检测波长。

3.2.2 供试品前处理方法的考察 考虑到样品含糖量较高，尝试采用通过D101大孔树脂吸附柱、通过中性氧化铝柱、加热回流不同时间和超声提取不同时间对样品进行前处理，并对提取溶剂和取样量进行考察，结果发现取样量为0.5 g，采用甲醇作为提取溶剂，超声处理 15 min就能达到较好的除去杂质的效果，色谱峰形比过柱的效果更理想。

3.2.3 色谱柱的比较 分别比较了Kromasil 100-5-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)、phenomenex Luna®C18(2)(5 μm，4.6 mm×250 mm)和YMC Hydrosphere C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)等3种不同品牌色谱柱的分离效果和测定结果，均无明显差异。由于同一成分在不同品牌色谱柱中的保留时间差异较大，因此应根据实际情况，调节检测波长的切换时间。

3.2.4 限度制定的讨论 由于此次研究收集到的样品批次较少，而且未收集到药材及相关批次成品的转移率数据，建议积累更多批次样品的测定结果，并考察转移率后再制定合适的限度。

3.3 结论 本文研究采用TLC法对橘红痰咳煎膏处方中的佐药五味子和苦杏仁进行定性鉴别，专属性强，重现性好；采用HPLC结合波长切换的方法，同时测定君药化橘红中柚皮苷和野漆树苷的含量，既能提高对目标化合物检测的准确性，又能简化数据处理过程、提高工作效率。查阅资料显示，目前已见有关橘红痰咳方的文献均未对五味子和野漆树苷进行质量控制，本文的研究项目既能有效提高橘红痰咳煎膏的质量可控性，也能为统一橘红痰咳方的质量标准奠定研究基础和提供技术支持。