霞多丽葡萄营养系果实中酚类和香气物质研究

刘政海，董志刚，李晓梅，谭敏，杨镕兆，贺晋瑜，赵旗峰

(山西农业大学果树研究所,山西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心,山西 太原, 030031)

葡萄(Vitisvinifera)为多年生藤蔓植物，在我国有着悠久的葡萄种植历史[1]，近几年，我国从国外引进大量优良酿酒品种，但所有的品种，尤其是具有古老起源的品种会出现品种退化的现象，无性系选种是指在无性繁殖的果树群体中，为了维持、提升品种原先具有的优良形状对优良植株进行选取、繁育的工作[2]。PAGLARANI等[3]从35株葡萄中根据产量、串重、果实重、含糖量等指标，鉴定出最具发展潜力的14株营养系。以湖南省怀化县的商品葡萄园4个红色无性系和2个白色无性系为例，研究发现高山4号和白葡萄1号无性系中C6和C9挥发物含量最高[4]。酿酒葡萄品质主要取决于葡萄品种及相应的生态条件[5]。营养系选种是品种选育的有效方法，与常规育种方法相比具有成本低、见效快等优点[2]。酚类物质是葡萄酒最重要的风味物质之一，且具有生物活性功能[6]。果实的酚类物质组成和含量受生长条件、品种和果实成熟度等多种因素影响，但品种的基因型对其影响超越任何环境因素[7]。任瑞华等[8]以雷司令和小芒森为材料，发现高果皮百分比、较小果粒及果实糖含量高有益于葡萄果实酚类物质的积存。香气是衡量葡萄果实和葡萄酒感官品质的重要指标，葡萄果实可挥发性状态的香气主要包括醛、芳香化合物、萜、酯类等，共同作用下形成葡萄酒最终的香气。

霞多丽(Chardonnay)别名雪当利、莎当妮等，欧亚种，原产于法国勃艮第，是世界著名的酿造白葡萄酒的优良品种。在许多国家都有栽培，自1979年从法国引进中国，近几年霞多丽在山西、山东、河北、内蒙古、新疆等省栽培面积逐渐增加，栽培适宜当地生态气候条件的营养系决定着当地葡萄酒的品质和风格，国内外关于霞多丽葡萄酒品质的研究较多[9-10]，对霞多丽不同营养系的成熟果实香气以及果实不同部位在生长发育阶段的酚类物质研究甚少。本试验以霞多丽4个营养系果实为试验材料，对各个营养系的成熟果实的香气物质的种类、含量、香气活性值以及不同生长发育阶段的酚类物质含量进行比较分析，以期选育出适宜黄土高原地区栽培的最优霞多丽葡萄营养系，为酿酒葡萄育种材料选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

以霞多丽4个营养系霞多丽76、霞多丽95、霞多丽96、霞多丽277为材料，引种于中法庄园，定植于2010年，以株行距0.8 m×2.5 m种植于山西农业大学果树研究所酿酒葡萄采穗圃[N37.34°，E112.49°，海拔(846±5) m]，常规栽培管理，该地区属温带大陆性季风气候，年均温10.6 ℃，160～180 d的无霜期，均为倾斜式单龙蔓“厂”字形立架栽培。霞多丽葡萄果实分别于盛花后40 d(2020年7月3日)、60 d(2020年7月23日)、80 d(2020年8月12日)、100 d(2020年9月1日)、110 d(达到生产成熟)进行采样。

氢氧化钠、正丁醇、碳酸钠、氯化钾、甲醇、醋酸钠、氯化铝、乙醇、亚硝酸钠等，均为分析纯；4-甲基-2-戊醇、乙醇、单宁酸、儿茶素，均为色谱纯。

1.2 仪器与设备

50/30 μm固相微萃取(solid phase micro extraction, SPME)萃取头(PDMS/CARDVB)，北京华尔博科技有限责任公司；7890-5975B气相色谱-质谱联用仪(gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS)、HP-INNOWAX毛细管柱，美国安捷伦公司。

1.3 实验方法

1.3.1 果实性状调查

参照《葡萄种质资源描述规范和数据标准》对4个营养系成熟果实基本品质性状的鉴定。

1.3.2 酚类物质含量的测定

采用Folin酚法测定总酚、单宁含量，用单宁酸等价表示(mg/g FW)；总类黄酮含量测定采用氯化铝比色法，根据儿茶素(0～100 mg/L)标准曲线计算总类黄酮含量；采用香草醛-盐酸法测定黄烷醇，结果以儿茶素等价表示(mg/g FW)[11]。

1.3.3 果实挥发性香气物质的测定

1.3.3.1 挥发性香气物质提取

将葡萄果实放进研钵内并且加入液氮，用研磨杵轻微敲碎葡萄使葡萄果实各部分分离，除去种子、果蒂，取50 g果肉并且往里面加1 g交联聚乙烯吡咯烷酮，在液氮作用下，通过冷冻研磨机将果肉磨成粉末状，将其装入50 mL离心管中，静置在4 ℃冰箱内12 h，每个重复装2管，离心转速为10 000 r/min条件下进行15 min，离心2次得到澄清葡萄汁液。

1.3.3.2 SPME及气相色谱-质谱联用仪(gas chromatograph- mass spectrometer，GC-MS)条件

在样品瓶中放入澄清葡萄汁液5 mL，加入1 g NaCl、磁力转子和10 μL(4-甲基-2-戊醇)内标后，盖上样品盖子并且立刻将其放到磁力搅拌加热台上，在40 ℃ 条件下保持30 min后，将活化好的SPME萃取头插入样品瓶上部，在40 ℃下吸附30 min后，立即将萃取头插入GC进样口，在250 ℃温度下解析8 min。

GC-MS条件：毛细管柱为60 mm×0.25 mm×0.25 μm，高纯氦气为其载气，流速为1 mL/min，手动进样不分流；程序升温为50 ℃下1 min后，以3 ℃/min的速度升温到220 ℃并保持5 min；质谱接口温度为 280 ℃，离子源温度为230 ℃，电离的方式为EI，电离能为70 eV，扫描范围为20～350 u。

1.3.3.3 香气物质定性和定量

香气物质定性：根据GC-MS分离得到的质谱全离子扫描图谱，将与标样一样的香气物质进行定性。对于没有标样的香气物质，将其与己有文献相似图谱进行比对，还可使用计算机检索NIST 11标准库进行半定性。

香气物质定量：根据葡萄的挥发性香气浓度高低，用目标香气的标准品制备香气物质标准曲线，根据标准曲线对果实中相应香气物质进行定量，如果香气物质没有标样，可以根据与香气化合物碳原子数接近的或者化学结构接近的标样进行半定量。

1.4 统计分析

利用Excel 2019、SAS 9.2进行数据分析与绘图。

2 结果与分析

2.1 霞多丽葡萄营养系果实基本品质比较

霞多丽葡萄4个营养系成熟果实基本品质如表1所示，霞多丽95平均穗重、果穗长宽均显著高于霞多丽76(P<0.05)；4个营养系果梗长无显著差异。霞多丽277可溶性固形物分别比霞多丽76、霞多丽95、霞多丽96高15.73%(P<0.05)、10.81%(P<0.05)、14.12%(P<0.05)；霞多丽76固酸比、果形指数显著高于其他3个营养系；霞多丽277皮肉比为0.23，显著高于其他3个营养系；霞多丽葡萄4个营养系百粒重为2.45～3.00 g，其中霞多丽76的种子百粒重显著高于霞多丽95和霞多丽277(P<0.05)；霞多丽96的pH值显著低于其他3个营养系。

表1 霞多丽葡萄4个营养系果实基本品质Table 1 Basic quality of Chardonnay grape fruit from four clones

2.2 霞多丽葡萄营养系果实酚类物质比较

2.2.1 霞多丽葡萄营养系果皮和果肉中单宁含量比较

霞多丽4个营养系盛花后不同时期果皮中单宁含量如图1-A所示。单宁含量从盛花后40 d至果实成熟期呈先下降又上升的趋势，盛花后40 d时，霞多丽96果皮中单宁含量为14.23 mg/g，显著高于其他3个营养系；霞多丽96果皮中单宁含量在5个发育期含量均较高，在果实成熟期霞多丽96果皮中单宁含量显著高于霞多丽76和霞多丽95。

霞多丽4个营养系果肉中单宁含量如图1-B所示。4个营养系果肉中单宁含量呈先下降后上升的趋势，在盛花后40 d时，霞多丽277果肉中单宁含量为5.41 mg/g，显著高于其他3个营养系，霞多丽277在盛花后60、80 d时下降幅度较大，但在果实完全成熟时霞多丽277果肉中单宁含量显著高于霞多丽76和95。霞多丽95在盛花后100 d，果肉单宁含量为2.24 mg/g，分别比霞多丽76、霞多丽96、霞多丽277高33.89%(P<0.05)、204.70%(P<0.05)、48.21%(P<0.05)。霞多丽96果肉中单宁在盛花后60 d、盛花后80 d、果实成熟期含量分别为5.39、2.62、3.21 mg/g，显著高于其他3个营养系。

2.2.2 霞多丽葡萄营养系果皮和果肉中总类黄酮含量含量比较

如图2-A所示，为霞多丽葡萄营养系盛花后不同时期果皮中总类黄酮含量，其中从盛花后40 d起果皮中总类黄酮含量逐渐下降而后又上升的趋势。霞多丽4个营养系果皮中总类黄酮含量在各时期差异基本一致，其中霞多丽96果皮中总类黄酮含量在盛花后40 d、盛花后60 d、盛花后80 d、盛花后100 d和果实成熟期的含量均显著高于其他3个营养系。

由图2-B中霞多丽4个营养系果肉中总类黄酮含量可知，总类黄酮含量从盛花后40 d至果实成熟期总体呈下降趋势。其中霞多丽96果肉中总类黄酮含量在盛花后60 d以及盛花80 d含量分别为0.18、0.13 mg/g，均显著高于其他3个营养系。在盛花后40 d和果实成熟期，霞多丽277果肉中总类黄酮含量分别为0.26、0.09 mg/g，均显著高于其他3个营养系。

2.2.3 霞多丽葡萄营养系果皮和果肉中黄烷醇含量比较

霞多丽4个营养系盛花后不同时期果皮中黄烷醇含量如图3-A所示，在霞多丽葡萄在成熟的过程中黄烷醇含量先下降后上升，在盛花后60 d，霞多丽96果皮中黄烷醇含量为11.09 mg/g，显著高于霞多丽95和霞多丽277。霞多丽96果皮中黄烷醇含量在盛花后40、80、100 d及果实成熟期显著高于其他3个营养系。

A-果皮；B-果肉图1 霞多丽葡萄营养系盛花后不同时期果皮和 果肉中单宁含量Fig.1 Skins and flesh tannin content in clones of Chardonnay grape at different periods注：不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)

A-果皮；B-果肉图2 霞多丽葡萄营养系盛花后不同时期果皮和 果肉中总类黄酮含量Fig.2 Skins and flesh total flavonoids content in clones of Chardonnay grape at different periods

霞多丽4个营养系不同时期果肉中黄烷醇含量如图3-B所示，霞多丽4个营养系在盛花后40 d时，果肉中黄烷醇含量较高，在盛花后80～100 d时果肉中黄烷醇含量降到最低，在果实成熟期，霞多丽277果肉中黄烷醇含量为0.26 mg/g，分别比霞多丽76、霞多丽95、霞多丽96高73.83%(P<0.05)、171.47%(P<0.05)、35.38%(P<0.05)。

A-果皮；B-果肉图3 霞多丽葡萄营养系不同时期果皮、果肉中黄烷醇含量Fig.3 Skins and flesh flavanols content in clones of Chardonnay grape at different periods

2.3 霞多丽葡萄营养系果实中香气比较

2.3.1 霞多丽葡萄营养系成熟果实中香气物质种类

霞多丽葡萄营养系成熟期果实中香气种类数如表2所示，霞多丽4个营养系共检测到96种香气化合物，其中在霞多丽76果实中检测到香气种类最多，为95种。酯类物质主要是呈现果香味，具有使葡萄酒中各种香气物质的平衡、融洽、协调的状态的功能，酯类香气物质在4个营养系果实中香气种类最多，其中霞多丽76果实中酯类香气种类最多为35种。萜烯类和降异戊二烯类大多具有怡人的果香、花香，是葡萄酒中品种香的主要组分，其对葡萄酒的香气有着很大的奉献，霞多丽76果实中萜烯及降异戊二烯类物质物质有17种。

表2 霞多丽葡萄营养系成熟期果实中香气种类数Table 2 Number of aroma species in grape clones of Chardonnay at mature stage

2.3.2 霞多丽营养系成熟期果实不同香型香气活力值(ordor active values，OAVs)比较

图4所示为霞多丽4个营养系果实中各香气类别的OAVs，OAV是香气成分含量与嗅觉阈值的比值，霞多丽76水果香OAVs为10.72，分别比霞多丽95、霞多丽96和霞多丽277高78.71%(P<0.05)、74.04%(P<0.05)、76.56%(P<0.05)。霞多丽76果实中花香值OAVs为28.39，显著高于其他3个营养系果实中花香OAVs(P<0.05)。霞多丽4个营养系果实中植物香和脂肪香差异不显著，4个营养系植物香OAVs值均在26以上，而4个营养系脂肪香OAVs均低于2。

A-果皮；B-果肉图4 霞多丽营养系成熟期果实中不同香气类型香气活力值Fig.4 Odor active values of different aroma types in Chardonnay clones at mature stage

3 讨论

酿酒葡萄果实的基本品质、酚类物质、香气物质等指标决定酿造葡萄酒的好坏。魏烈权等[12]通过测定葡萄果实中可溶性糖含量、可滴定酸含量、总酚含量、单宁含量等9项常规指标评价嘉峪关10个酿酒葡萄品种，测出黑比诺、佳美、美乐这3个品种在嘉峪关地区品质优于其他品种。谭伟等[13]研究发现白色品种小白玫瑰455在果实中种果皮的单宁含量高于果肉的单宁含量，这与霞多丽4个营养系在果皮中酚类物质高于果肉中酚类物质含量结论相符。不同发育时期，果实中单宁含量差异明显[14]，霞多丽4个营养系果皮和果肉中单宁含量呈先下降后升高的趋势，在后期形成更多的缩合单宁，霞多丽96和霞多丽277在果实完全成熟时单宁含量最高，含有不同聚体的单宁分子多，使得酿造的葡萄酒苦涩感更丰富。酿酒葡萄果实中酚类物质含量受品种、环境等因素影响，品种是其影响果实中酚类物质的主要内在因素[15]。张娟等[6]以多种红色酿酒品种为试材分析了酚类物质含量，发现不同品种间果实中酚类物质含量差异显著，其中葡萄皮中总酚含量为12～125 mg/100g，果肉中总酚含量为1.24～3.24 mg/100g。本研究表明霞多丽4个营养系果实酚类物质含量存在显著差异。代红军等[16]研究水杨酸对赤霞珠葡萄白藜芦醇、总类黄酮含量影响，研究表明，赤霞珠葡萄果皮中总类黄酮含量在幼果期和完熟期较高。本研究中霞多丽4个营养系果皮中总类黄酮含量在盛花后40 d和果实成熟期含量较高结论相似。胡丽等[17]在欧亚种和山欧杂种中检测到12种黄酮醇物质，在双丰葡萄中只检测到4种黄酮醇物质，不同品种品系间黄酮醇种类和含量有明显差异，霞多丽96果皮中和霞多丽277果肉中总类黄酮含量显著最高，可能存在黄酮种类高于其他2个营养系。温鹏飞等[18]以赤霞珠为试材研究土壤干旱对酿酒葡萄果肉中黄烷醇类多酚含量的影响，研究发现在果实发育过程中果肉中黄烷醇类多酚的积累模式并未受土壤干旱的影响而改变，并且在果实发育过程中黄烷醇类多酚的积累为幼果期含量最高，随着果实的发育而逐渐下降，在果实成熟期时略有回升。这与本实验霞多丽葡萄4个营养系在盛花后果肉中黄烷醇含量逐渐下降又有回升的研究结果基本一致。

同一产地酿酒葡萄品种不同，香气组成的种类、含量及比例均存在明显差异。秦欢等[19]以重庆3个白葡萄品种成熟果实研究材料，研究发现不同品种白葡萄果实香气成分及含量、种类差异明显。ROCHA等[20]以4种白葡萄品种为试材通过检测分析，发现不同品种间关于香气物质的浓度和种类有显著差异。香气物质的浓度和种类不同使得霞多丽4个营养系同一类香气OAV不同，从而导致其香气特征的差异。以意大利酿酒葡萄品种果实为材料，分析果实酚类物质含量和挥发性香气成分，研究发现7个品种果实干果香、脂肪味/奶油味、烘烤味、橡木味和香料味OAV均低于1[21]，这与本实验中霞多丽4个营养系脂肪香含量较低研究结果相似。

在果实成熟期，霞多丽96在果皮中单宁、总类黄酮、黄烷醇的含量优于其他营养系。霞多丽96果肉中单宁优于其他营养系。在霞多丽葡萄4个营养系中共测得96种挥发性香气物质种类，其中霞多丽76醇类物质种类最多，且是检测到的香气种类最为丰富的营养系。霞多丽76营养系的水果香、花香OAVs均显著高于其他3个营养系。在黄土高区产区，霞多丽96和霞多丽277可作为高酚类物质含量的霞多丽营养系，霞多丽76可作为具有丰富香气物质种类和含量的营养系进行栽培。