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黑柿叶中单宁提取工艺研究

2022-03-01程洪斌窦思远李泯锟

现代园艺 2022年3期
关键词:单宁葡萄球菌乙醇

宋 超,程洪斌,窦思远,李泯锟,王 耘*

(金陵科技学院园艺园林学院,江苏南京 210038)

柿子在我国有着悠久的历史,种植面积和产量位居世界之首。柿果实营养丰富,含有多种抗氧化功能性成分[1],其中单宁是柿功能性成分中最具关注的一种,它赋予柿子特有的涩感,多羟基酚类的结构决定了它还有吸收紫外线、清除自由基、防腐和美白保湿等诸多优良特性。目前柿单宁提取多以果实为原料,柿叶利用较少,而研究发现,柿叶中也富含多酚类、黄酮类、萜类、鞣质等多种功能性成分[2],以柿叶为原料提取柿单宁,可以减少果实资源的浪费。

单宁的提取方法多种多样,例如水提取法、有机溶剂-水提取法、仪器辅助提取法等,目前常采用超声波辅助法提取单宁[3-4]。如余先纯等[5]采用该方法以70%的丙酮溶液为溶剂提取野柿叶中的单宁,曾鑫海等[6]用此法以及邻二氮菲分光光度法来提取橄榄中的单宁,王秋亚[7]用50%乙醇提取苦菜中的单宁,从提取温度、提取时间、料液比等方面考察对单宁提取量的影响。黑柿是黑色柿品种[8],前期的研究发现,黑柿叶中单宁含量相比较红柿叶中多,因此,黑柿叶可以作为一种较好的提取单宁的新资源。关于黑柿叶单宁提取方法和抑菌活性相关的报道极少[9],本试验在前人研究基础上,通过单因素试验和正交试验,研究了超声辅助提取黑柿叶中单宁的最佳工艺,并对黑柿叶中的单宁抑菌性进行了研究,该结果为黑柿叶资源开发利用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 柿叶的制备

试验当天在金陵科技学院园艺站进行黑柿叶片采样,将样品在95℃条件下烘干(至恒重),研磨后过40目筛,粉末密封保存置于干燥器中,留待后续试验使用。

1.2 黑柿叶中单宁的提取及测定方法

参照韩卫娟等[10]及于晓锐等[11]对单宁的提取方法,用电子天平精密称取0.2g黑柿叶粉,优化提取液乙醇的体积分数,优化不同料液比,在固定温度下超声提取,过滤,收集滤液,定容至25mL。

通过牛广财等[11]使用的福林-酚比色法测定(略作修改),其中饱和碳酸钠溶液作为提供稳定的碱性环境的溶液,静置显色反应时间改为2h。标准品为没食子酸,并绘制标准曲线,进一步测定样品。

公式中:x是利用标准曲线计算所得到的浓度,mg/mL;V为定容容量,mL;m是样品质量,g;N为稀释倍数。

1.3 超声提取黑柿叶中单宁的单因素试验

1.3.1 不同料液比对提取效果的影响。在60%乙醇、温度60℃、超声频率为100W条件下,分别以1︰20、1︰30、1︰40、1︰50和1︰60(g︰mL)5个料液比进行试验,提取40min,观察不同料液比对提取单宁的影响。

1.3.2 乙醇浓度对提取效果的影响。利用弱酸性醇-水体系能够更好地溶出样品中的缩合单宁[13]。在料液比1︰40(g︰mL)、温度60℃、超声频率为100W的条件下,选择40%、50%、60%、70%和80%5个梯度的乙醇浓度进行试验,提取40min,探索乙醇体积分数对提取效果的影响。

1.3.3 不同温度对提取效果的影响。在料液比1︰40(g︰mL)、60%的乙醇溶液、超声频率为100W的条件下,选取提取温度分别为40、50、60、70和80℃,提取40min,分析单宁提取效果。

1.3.4 比较不同时间对提取效果的影响。在料液比1︰40(g︰mL)、60%的乙醇溶液、超声频率为100W、温度为50℃条件下,选取成梯度提取时间进行试验,时间分别为10、20、30、40和50min,分析单宁提取效果。

1.4 正交试验

根据对上述单因素试验的结果分析后选出了4个因素中较好的水平进行正交试验,确定最佳提取因素和水平(表1)。

表1 黑柿叶单宁提取的正交试验因素水平

1.5 对细菌生长的影响

挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌,活化2代后,37℃过夜培养,作为测试菌菌液。取测试菌液50μL接种于25mL培养液中,以提取单宁用无菌水配制成浓度为2.5%、1.25%和0.625%的溶液,在培养液中各添加2.5mL单宁溶液,无菌水为空白,每隔2h取样测定600nm下的吸光值,每组做3个平行。

1.6 统计与分析

采用SPSS10.0软件进行数据分析,数据处理及制图利用Excel2019进行。

2 结果与分析

2.1 单宁标准曲线

以没食子酸质量浓度为横坐标绘制了标准曲线(见图1),没食子酸浓度在0~0.10mg/mL范围内,呈现出较良好的线性关系,此范围内的线性回归方程为y=15.235x+0.0617,R2=0.9983。

图1 没食子酸标准曲线

2.2 单因素结果分析

2.2.1 不同料液比的影响。伴随料液比的逐渐增加,提取量大致呈现出先上升后缓慢下降的趋势,1︰50时的提取量比1︰40时稍高,但是1︰40时,单宁在溶剂中的溶解基本达到饱和,考虑到提取效果和成本的影响及后续浓缩的时间和能耗,可考虑低料液比。

图2 料液比对单宁提取的影响

2.2.2 不同乙醇浓度的影响。单宁的提取量随乙醇浓度增加先升高再下降,主要原因是低浓度时随着乙醇浓度升高,单宁与另外一些物质的键合被打开,从而游离出来,但是高浓度时,水分的减少使得溶液通透性下降,单宁提取率随之下降[14]。

图3 乙醇溶液浓度对单宁提取量的影响

2.2.3 不同提取温度的影响。温度50℃有提取峰值,在此之前升高温度可增加单宁在水溶液中的溶解度,而高于50℃后,黑柿叶中的单宁提取量明显下降,当温度达到80℃时,提取量为123.58mg/mL,仅略高于40℃时(221.15mg/mL)的一半。温度过高,可能加速单宁的氧化和分解或引起单宁结构的变化,导致结果测定出提取的单宁量偏低。因此,传统提取条件下长时间高温不利于活性高的单宁提取。

图4 提取温度对单宁提取的影响

2.2.4 不同提取时间的影响。随着提取时间的延长,单宁提取量有较明显的增加,40min后不再增加。有研究表明,时间过长,会使得单宁中的酚羟基经氧化反应变成酮基,从而使得提取量下降[15]。超声辅助提取既可缩短提取时间又能降低提取温度,可提高柿叶中单宁的提取率。

图5 超声波提取时间对单宁提取量的影响

2.3 最佳提取工艺的优化

在单因素试验的结果上,正交试验结果及极差分析可知(表2),影响黑柿叶单宁提取率的4个因素的主次关系为提取温度(A)>料液比(D)>提取时间(B)>乙醇浓度(C)。最佳提取条件为A1B2C2D3,即提取温度50℃,提取时间40min,60%乙醇,料液比1︰50(g︰mL)。

表2 黑柿叶片单宁提取的正交实验结果

2.4 柿叶单宁对细菌生长影响的分析

试验采用分光光度法,以光度值来表示细菌效果。由图6可知,只有2.5%黑柿叶单宁在大肠杆菌生长至对数期之前稍微有抑制效果,其他浓度都没有抑制作用。由图7可知,不同浓度的黑柿叶单宁对金黄色葡萄球菌的抑制效果都较好,4h后对照组中金黄色葡萄球菌开始快速增殖,至6h后悬浮液的吸光值明显高于试验组,且之后试验组的增殖一直很缓慢,单宁浓度相对较高时抑菌性更好一点。说明黑柿叶中单宁对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用。

图6 黑柿叶单宁对大肠杆菌生长的影响

图7 黑柿叶单宁对金黄色葡萄球菌生长的影响

3 结论

(1)根据上述优化工艺,利用60%乙醇、1︰50(g︰mL)料液比、超声频率100W的条件下,50℃提取40min时,可以较好地提取出黑柿叶中的单宁成分。

(2)不同浓度的单宁溶液对2种不同细菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)的繁殖生长有不同的影响。与喷洒了无菌水的2种细菌培养基相比,添加了单宁溶液的金黄色葡萄球菌培养液中,菌体增殖较缓,而对大肠杆菌的抑制作用不明显,由此可明显看出,单宁溶液具有一定的抑制金黄色葡萄球菌的能力,2.5%单宁溶液的抑菌效果更好一些。

黑柿叶片是提取单宁的一种很好的原料,可有效利用黑柿叶资源,研发天然防腐剂,对资源合理应用和食品防腐具有较好的研究意义。

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