ABCA1通过激活EGFR/STAT3信号通路对胃癌上皮间质转化的影响

金 泳，杜 洪，夏 英，项婷婷，韦四喜，孙 铭，黄 海

胃癌(gastric cancer, GC)是世界范围内高发病率、高病死率的肿瘤之一[1]，在我国，国家癌症中心发布2020年预计胃癌发病率达24.30/10万[2]。胃癌早期起病较为隐匿，因此大部分患者就诊时病程已经进入中晚期，肿瘤细胞已扩散转移[3]，而胃癌发生发展的病理分子机制尚未阐明也为肿瘤的诊疗带来困难，因此，探究胃癌致病及远处转移机理将有助于改善胃癌的诊断和治疗。ATP结合盒亚家族A成员1(ATP binding cassette subfamily A member 1，ABCA1)是三磷酸结合盒转运体超家族的重要成员之一，研究[4]表明ABCA1主要参与胆固醇逆向转运及胆固醇代谢，但近年来有研究报道ABCA1在肿瘤的进展中扮演重要角色，参与肿瘤细胞增殖、转移及肿瘤血管生成等生物学现象[5]，与肿瘤患者预后不良相关[6]。然而，ABCA1在胃癌中的作用及其相关分子机制却鲜有报道。该研究探讨ABCA1在胃癌发生发展过程中可能的分子机制，以期寻找胃癌治疗靶点或分子生物学标记，为胃癌的诊断和治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1胃癌组织及细胞来源 GC细胞系AGS、MKN45、HGC-27及胃黏膜细胞系GES-1购自中国科学院细胞库；293T细胞系由兰州大学金卫林教授实验室惠赠。收取2020—2022年贵州医科大学附属医院胃肠外科25例手术前未经过化疗、放疗和免疫治疗的胃腺癌患者胃癌组织，同时取相邻癌组织间隔5 cm以上癌旁组织作为对照; 组织标本均有唯一识别标记，留存于液氮中；本研究所用组织样本均通过贵州医科大学附属医院医学伦理委员会审查(审批号：2020伦审第106号)。

1.1.2shRNA和引物 shABCA1-1序列: 5′-GCGACTCCACATAGAAGAC-3′； shABCA1-2序列：5′-GACGTATGTGCAGATCATA-3′，ABCA1的 shRNA质粒购于广州艾基生物技术有限公司。ABCA1 PCR引物序列：上游5′-ACATCCTGAAGCCAATCCTGA-3′，下游5′-CTCCTGTCGCATGTCACTCC-3′；β-actin PCR引物序列：上游5′-ATTGGCAATGAGCGGTTCCG-3′，下游5′-CTGTGTTGGCGTACAGGTCT-3′，以上引物序列均由本课题组设计，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.3主要试剂和仪器 RPMI-1640培养基及TRIzol Reagent购于美国Invitrogen公司；总RNA抽提试剂盒购于上海生工生物工程股份有限公司；逆转录试剂盒及SYBR Premix Ex TaqⅡ 购于日本Takara公司；Matrigel购于美国Corning公司；ABCA1鼠源性单克隆抗体购于美国Abcam公司；表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)及p-EGFR、信号传导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)及p-STAT3兔源性多克隆抗体购于杭州华安生物技术有限公司；β-actin鼠源性单克隆抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗购于杭州联科生物技术股份有限公司；RIPA裂解液及BCA蛋白浓度测定试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；Immobilon ECL Ultra Western HRP底物化学发光液购于美国Millipore公司；Bio-Rad凝胶成像分析系统(ChemiDoc XRS+)由美国Bio-Rad公司生产；实时荧光定量PCR仪(Roche LightCycler480)由瑞士Roche公司生产。

1.2 方法

1.2.1生物信息学分析

1.2.1.1TIMER数据库 通过肿瘤免疫评价数据库(tumor immune estimation resource，TIMER，https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析ABCA1在不同肿瘤中的表达。该数据库Diff Exp模块可分析肿瘤中某个基因在肿瘤和相邻正常组织之间的差异表达，使用Wilcoxon检验评估差异表达的统计显着性。分析流程如下：①Version: TIMER2.0；②diff Exp模块；③ Gene Symbol: ABCA1。

1.2.1.2UALCAN数据库 亚拉巴马大学癌症数据库(University of Alabama Cancer Database，UALCAN，http://ualcan.path.uab.edu)可以用来分析基于TCGA数据库中靶基因在肿瘤与正常组织中的表达及其与相关临床参数的关系。筛选条件如下：①Gene symbol: ABCA1；②TCGA dataset: Stomach adenocarcinoma。

1.2.1.3Kaplan-Meier Plotter数据库 Kaplan-Meier Plotter数据库(https://kmplot.com)可根据目的基因的各种分位数表达将患者样本分为两组，比较两组患者队列并计算95%CI的风险比和P值，分析患者生存期。筛选条件如下：①Cancer: gastric cancer；②Gene symbol: ABCA1；③ Survival: OS；④Split patients by: auto select best cutoff；根据表达水平中位数分为高、低表达组，绘制 Kaplan-Meier 生存曲线。

1.2.2细胞培养 胃癌细胞复苏后，培养于含有10%胎牛血清(FBS)和100 U/ml青链霉素的RPMI-1640培养液中，将细胞置于37 ℃、5%CO2的恒温恒湿培养箱中培养，待细胞融合85%左右时，按1 ∶3 消化传代。

1.2.3shRNA与慢病毒感染 ABCA1的短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)质粒购于广州艾基生物技术有限公司。将HEK293T细胞与pLKO.1 shRNA、psPAX2和pMD2.G质粒共转染，转染后48 h，将含有病毒的上清液与聚凝胺(8 μg/ml) 混合，加入靶细胞中孵育培养24 h。然后使用嘌呤霉素(2 μg/ml)筛选转导细胞。

1.2.4RNA提取及实时荧光定量PCR 采用上海生工生物总RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA，按照Takara逆转录试剂盒说明将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，按SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂说明进行PCR扩增。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.2.5细胞划痕实验 以5×105个/ml细胞接种于6孔板中，常规培养至90%汇合后，使用无血清培养基饥饿培养24 h，用10 μl无菌移液器吸头在细胞培养板底部划痕，用PBS清洗去悬浮细胞，将培养基更换为含有0.1% FBS的RPMI-1640继续培养，采集第0、24、48 h划痕图片，使用Image J软件分析划痕面积并计算划痕愈合率。

1.2.6Transwell实验

1.2.6.1Transwell细胞迁移实验 收集细胞，用无血清培养基培养液重悬，计数，调整细胞浓度为2×105个/ml，取200 μl细胞接种到8 μm孔径的Transwell小室中，下室中加入600 μl的10%FBS培养基，培养24 h后取出小室。用棉签去除上室细胞，将迁移到下孔的细胞用甲醇固定，0.1%结晶紫染色，PBS漂洗，在200倍显微镜下观察。采集并计算3个随机选择的区域中的细胞数。

1.2.6.2Transwell细胞侵袭实验 将基质胶用无血清培养液按1 ∶8稀释，加入Transwell小室上室并放入培养箱中凝固过夜。收集细胞，用无血清培养基培养液重悬，计数，调整细胞浓度为2×105个/ml，每个小室内加入细胞悬液200 μl，下室中加含20% FBS培养基600 μl。培养48 h后取出小室，用棉签去除上室细胞，将侵袭到下室的细胞用甲醇固定，0.1%结晶紫染色，PBS漂洗，在200倍显微镜下观察，计算3个随机选择的区域中的细胞数。

1.2.7Western blot实验 采用RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，经BCA法测定蛋白浓度。加入5×SDS蛋白上样缓冲液充分煮沸变性。取变性蛋白30 μg经10% SDS-PAGE电泳，利用湿转法将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上。5% BSA室温封闭1 h，4 ℃孵育一抗过夜。次日，TBST洗膜3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育1 h。TBST洗膜3次，每次10 min。最后，通过Immobilon ECL Ultra Western HRP底物化学发光液发光、显影，Bio-Rad凝胶成像分析系统拍照，Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值。

2 结果

2.1 生物信息学分析ABCA1在胃癌中的表达及其对胃癌患者生存预后的影响通过TIMER数据库分析ABCA1在不同肿瘤类型中的表达情况，结果显示ABCA1在胃癌中过表达(P<0.001，图1A)；基于UALCAN数据库分析ABCA1在胃癌组织和正常组织中的表达及其在胃癌不同分期分级中的表达情况，结果显示，ABCA1在胃癌组织中表达上调(P<0.001，图1B)，且其表达与胃癌分期、分级相关(图1C、D，P<0.001)；为进一步探究ABCA1表达与胃癌患者预后关系，利用Kaplan-Meier plotter数据库进行分析显示，ABCA1高表达胃癌患者总生存率(overall survival，OS)低与非高表达者(图1E，风险比HR=1.96，95%CI:1.62～2.37，P<0.000 1)。这些结果提示，ABCA1在胃癌发生发展中可能发挥着重要作用。

图1 生物信息学分析胃癌中ABCA1的表达A：ABCA1在不同肿瘤中的表达；B：ABCA1在胃癌中的表达；C：ABCA1在正常胃组织及不同胃癌分级中的表达；D：ABCA1在正常胃组织及不同胃癌分期中的表达；E：ABCA1的表达水平与胃癌患者生存率的相关性；与正常组织比较：*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001

2.2 ABCA1在胃癌组织和细胞系中的表达情况采用RT-qPCR检测25对临床胃癌组织样本中ABCA1的表达情况。如图2A所示，相比于癌旁组织，ABCA1在胃癌组织中表达上调，差异有统计学意义(t=3.936，P=0.000 6)。此外，RT-qPCR法检测不同胃癌细胞系中ABCA1的表达，如图2B所示，与胃黏膜细胞GES-1相比，ABCA1在胃癌细胞系HGC-27中高表达(F=101.6，P<0.001)。Western blot结果与RT-qPCR趋势一致(图2C)。

图2 ABCA1在胃癌组织和胃癌细胞系中的表达A：RT-qPCR检测25例胃癌及其对应的癌旁组织中ABCA1的表达；B、C：RT-qPCR及Western blot检测不同胃癌细胞系中ABCA1的表达水平；与癌旁组织比较：***P<0.001；与胃黏膜细胞系GES-1比较：###P<0.001

2.3 ABCA1对胃癌细胞侵袭、迁移及EMT的影响

2.3.1ABCA1稳定敲低胃癌细胞系的构建 选择ABCA1高表达的胃癌HGC-27细胞系，利用慢病毒介导的shRNA干扰技术敲低ABCA1，通过RT-qPCR及Western blot验证ABCA1敲低效率(图3)，与sh-NC组相比，shABCA1组ABCA1的表达量显著减少，表明敲减成功(P<0.001)。

图3 RT-qPCR及Western blot验证ABCA1敲减效率A、B：RT-qPCR及Western blot实验验证ABCA1敲低效率；a：sh-NC组；b：shABCA1-1组；c：shABCA1-2组；与sh-NC组比较：***P<0.001

2.3.2细胞划痕实验、Transwell实验观察敲低ABCA1对胃癌细胞HGC-27迁移、侵袭能力的影响 细胞划痕实验结果显示，24 h及48 h后shABCA1组划痕愈合率均低于sh-NC组，差异有统计学意义(P<0.01，图4A)。此外，Transwell实验结果显示(图4B)，相较于sh-NC组，shABCA1组经迁移穿过Transwell小室的细胞减少(F=130，P<0.001)，侵袭细胞数也减少(F=185，P<0.001)，差异具有统计学意义。即敲低ABCA1使得胃癌细胞HGC-27迁移、侵袭能力受到抑制。

图4 ABCA1对胃癌细胞的迁移和侵袭的影响A：细胞划痕实验检测细胞迁移能力 ×40；B：Transwell实验检测迁移及侵袭穿孔细胞数 ×200；a：sh-NC组；b：shABCA1-1组；c：shABCA1-2组；与sh-NC组比较：**P<0.01，***P<0.001

2.3.3Western blot检测ABCA1敲减后EMT相关蛋白的表达 为了探究ABCA1是否与胃癌EMT相关，通过Western blot检测ABCA1敲减后EMT相关蛋白的表达，如图5所示，与sh-NC组比较，shABCA1组的上皮细胞标志蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达上调(F=10.2，P<0.01)，而间充质细胞标志蛋白N-钙黏蛋白(N-cadherin)(F=22.76，P<0.01)和波形蛋白(Vimentin)表达下调(F=14.04，P<0.01)；相较于sh-NC组，shABCA1组EMT相关转录因子Snail、Zeb1、Twist表达量受到抑制(FSnail=12.08，FZeb1=11.38，FTwist=12.21，P<0.01)。综上，敲低ABCA1抑制胃癌细胞EMT进展。

图5 ABCA1对胃癌细胞EMT的影响A：sh-NC组；b：shABCA1-1组；c：shABCA1-2组；与sh-NC组比较：**P<0.01

2.4 ABCA1对EGFR/STAT3信号通路的影响Western blot实验结果显示，与sh-NC组相比，shABCA1组EGFR磷酸化水平下调(F=33.84，P<0.01)；相较于sh-NC组，shABCA1组STAT3的总表达量及磷酸化水平均降低(F=804.1，P<0.01)。见图6。

图6 ABCA1对EGFR/STAT3信号通路相关标志分子的影响A：sh-NC组；b：shABCA1-1组；c：shABCA1-2组；与sh-NC组比较：**P<0.01

3 讨论

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，我国是胃癌高发国家，尽管早期筛查和手术及放化疗提高了总体生存率，但胃癌的预后仍不乐观[7-8]。肿瘤的远处转移是胃癌患者高复发率和高病死率的重要原因之一[9]，EMT促进癌细胞的运动表型，在肿瘤的侵袭和转移中发挥着极其重要的作用[10]。因此，阐明胃癌侵袭转移的分子机制，寻找治疗新靶点或分子生物学标记，为胃癌的发现及靶向治疗提供理论依据，是提高胃癌患者生存率亟待解决的关键问题。

ABC 转运蛋白家族是一个高度保守的蛋白质家族，研究显示其主要参与细胞脂质转运，调节细胞胆固醇水平[11]。ABCA1是ABC转运蛋白家族的重要成员之一，被报道参与细胞胆固醇转运，调节脂质代谢[4]。胆固醇是细胞质膜的重要成分，影响胞膜的流动性，对细胞稳态维持必不可少，此外，胆固醇还富含脂筏，在细胞内信号转导中起着关键作用[12]。近年来，研究[13]显示胆固醇代谢可能在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，影响肿瘤细胞转移及EMT等生物学行为，ABCA1作为参与胆固醇代谢的重要成员，也被发现在三阴性乳腺癌组织中异常高表达[5]，在结直肠癌中过表达并通过促进肿瘤生长、EMT和caveolin-1 依赖性侵袭恶化结直肠癌预后[6]，发挥着促癌功能。然而，有研究显示ABCA1具有抗肿瘤活性，上调 ABCA1 表达将抑制癌细胞增殖[14]，促进癌细胞中线粒体介导细胞色素 C释放以导致细胞死亡[15]。由于目前ABCA1在肿瘤中的功能尚不十分明确， ABCA1在胃癌中的作用亦鲜有报道，因此，其在胃癌发展中的作用及机制值得探索。

在本研究中，首先通过生物信息学对胃癌中ABCA1的表达及其与胃癌患者生存预后等的相关性进行分析，提示ABCA1 在胃癌中表达上调，进一步敲低ABCA1进行相关细胞表型实验，表明ABCA1有促进胃癌侵袭、迁移及EMT等生物学行为。ABCA1通过介导胆固醇转运来调节细胞胆固醇含量及胆固醇脂筏水平，影响细胞动力学及细胞内信号转导从而影响细胞行为；此外，ABCA1部分锚定于细胞质膜，质膜是胞外信号传导的必经之路，故推测ABCA1在胞外信号传导至胞内过程中产生影响。本研究表明ABCA1可能通过调节EGFR/STAT3信号通路促进胃癌细胞侵袭、迁移及EMT，但ABCA1在胃癌中发挥促癌作用的具体机制还有待进一步探究。以上研究表明，ABCA1在胃癌中发挥着促癌功能，靶向 ABCA1可能作为胃癌诊断和治疗的潜在靶标。