2-BFI对氟化钠致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

徐 婉，张才溢，闫 微，耿德勤

地方性氟中毒(以下简称“地氟病”)是以氟骨症、氟斑牙为主要特征的一种慢性全身性疾病[1]。有研究[2]表明，过量氟暴露会导致中枢神经系统结构受损和功能障碍。唑啉化合物2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉[2-(2-benzofuranyl) 2-imidazoline, 2-BFI]是咪唑啉2受体的选择性配体，在中枢神经系统线粒体膜上强烈表达，有研究[3]表明2-BFI对神经系统具有保护作用。但是2-BFI对地氟病的神经毒性是否具有保护作用，还有待进一步研究。该实验通过应用SH-SY5Y细胞建立地氟病模型，观察细胞凋亡及对线粒体功能的变化，探究2-BFI对氟中毒的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂NaF购自上海阿拉丁试剂有限公司；2-BFI购自英国TOCRIS生物科技公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司；青链霉素溶液、CCK-8试剂盒、TRIzol购自徐州Vicmed公司；多功能酶标仪购自美国BioTek公司；倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司；cleaved caspase-3、Tubulin抗体购自美国CST公司；Bcl-2、Bax抗体购自沈阳万类生物科技有限公司；SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒、RIPA裂解液、增强型ATP检测试剂盒、线粒体红色荧光探针(Mito-tracker red CMXRos，TMRM)试剂盒(C1049B)购自上海碧云天生物技术公司；奥德赛激光成像系统购自美国LI-COR公司；Tunnel试剂盒(货号：MA0224)购自大连美仑生物公司；透射电子显微镜购自上海NULL公司。

精密称取NaF粉末41.99 mg，加入50 ml PBS缓冲液混匀至完全溶解，配制成20 mmol/L的储存液；在1 mg 2-BFI粉末中加入4.49 ml PBS缓冲液混匀至完全溶解，配制成1 mmol/L的母液，0.22 μm无菌过滤器过滤后于-20 ℃保存，按需要浓度培养基稀释后使用。

1.2 细胞培养与分组SH-SY5Y细胞购自中国科学院上海细胞库；SH-SY5Y细胞在DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清和1%青链霉素)中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。分组方法：① NaF筛选实验分组，将细胞随机分为对照组(不做处理)和实验组(加入浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 mmol/L的NaF培养24 h)[4]；② 2-BFI筛选实验分组，将细胞分为对照组(不做处理)、损伤组(仅NaF)、2-BFI组(NaF和浓度为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L的2-BFI培养24 h)[5]；③ 药物浓度筛选之后将SH-SY5Y细胞随机分为对照组(不做处理)、NaF组、NaF + 2-BFI组，处理24 h。

1.3 CCK-8法检测细胞活性将细胞按分组加入不同药物作用24 h后，加入CCK-8试剂10 μl，37 ℃孵育2 h，用酶标仪测量450 nm波长处吸光度(A)值。设置不含任何药物和细胞的等体积的培养液为空白孔。细胞存活率=(A实验孔-A空白孔)/(A对照孔-A空白孔)×100%。

1.4 ATP浓度测定吸除培养基，每孔加入200 μl裂解液，4 ℃、 12 000 r/min离心5 min，取上清液测定浓度：加100 μl ATP检测工作液到检测孔内，室温放置3 min，以消耗本底ATP。在检测孔内加入20 μl样品或标准品，迅速混匀，用荧光酶标仪进行测定，根据标准曲线计算出样品中ATP的浓度[6]。

1.5 线粒体膜电位检测应用TMRM染色检测线粒体膜电位。取出孔板，吸除细胞培养液，加入PBS洗涤1次，加入2 μl TMRM染色液和198 μl PBS，轻轻混匀。37 ℃孵育15 min后，移液器吸弃TMRM工作液，加入37 ℃预热的新鲜细胞培养液。用倒置荧光显微镜观察、拍照。

1.6 透射电子显微镜将药物处理好的细胞胰酶消化离心，收集细胞，用2.5%戊二醛固定、脱水、包埋、固化，将制备好的样本进行超薄切片，用3%醋酸铀-枸橼酸铅双重染色，然后用透射电镜进行观察、拍照。

1.7 TUNEL染色法用PBS洗涤细胞孔板后，加入组织固定液于室温下固定30 min，通透5 min，加入50 μl TUNEL检测液，使检测液均匀覆盖在样本上，37 ℃避光孵育60 min，DAPI染色液室温孵育5 min。荧光显微镜下观察细胞染色结果，显示红色荧光的细胞为凋亡细胞。细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.8 蛋白质印迹法每个大皿加入150 μl细胞裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)，裂解完全后置于提前预冷至4 ℃的离心机中，12 000 r/min转速下离心20 min。通过BCA法测定蛋白浓度，配平后煮沸使蛋白充分变性。15% SDS-PAGE电泳分离蛋白，湿转至NC膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗于4 ℃冰箱孵育过夜，二抗室温孵育2 h后使用奥德赛系统扫描条带，用Image J软件分析图像，以目的蛋白与内参蛋白的吸光度比值作为结果进行统计分析。

2 结果

2.1 NaF对SH-SY5Y细胞活性的抑制作用CCK-8结果显示，SH-SY5Y细胞的生长受到不同浓度的NaF的抑制，且细胞存活率随NaF浓度的升高呈下降趋势。与对照组相比，NaF 1.5 mmol/L组(F=12.89，P<0.05)、NaF 4.0 mmol/L组(F=12.89，P<0.001)细胞存活率下降，差异有统计学意义。以上提示NaF 1.5 mmol/L时开始出现明显抑制作用，当NaF浓度为4.0 mmol/L时，细胞抑制作用过度。当NaF质量浓度太低时，不能有效抑制细胞增殖，而NaF浓度过高则会引起细胞死亡过量，因此本实验选用2.0 mmol/L处理24 h作为后续研究的最佳浓度。见图1。

图1 NaF对细胞增殖的影响与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2 2-BFI对SH-SY5Y细胞增殖的影响用2.0 mmol/L NaF处理24 h后再加入不同浓度的2-BFI处理24 h。CCK-8结果显示，当2-BFI浓度在2.5 μmol/L到10 μmol/L之间，细胞活性随药物浓度的升高而升高。与NaF组相比，2-BFI浓度为10 μmol/L时细胞存活率最高为99.16%(F=21.18，P<0.001)，差异有统计学意义；当2-BFI浓度大于10 μmol/L时，细胞存活率随2-BFI浓度升高反而下降，2-BFI浓度为40 μmol/L时，细胞存活率与10 μmol/L组相比，差异有统计学意义(F=21.18，P<0.01)。见图2。以上说明2-BFI发挥保护作用存在一个最佳浓度范围，浓度过高对细胞会产生损伤作用。因此，2-BFI最佳作用浓度为10 μmol/L。

图2 2-BFI对细胞增殖的影响与对照组比较：**P<0.01；与NaF组比较：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与NaF+2-BFI 10 μmol/L组比较：&&P<0.01

2.3 2-BFI对SH-SY5Y细胞线粒体形态的影响通过电镜观察可知，对照组SH-SY5Y细胞线粒体呈椭圆形，线粒体嵴清晰，结构完整；NaF组线粒体出现不同程度结构缺失，线粒体肿胀，结构松散，甚至部分呈空泡状，形态延长，出现丝状和管状线粒体；2-BFI组大部分线粒体结构正常，有部分嵴模糊，但基本具有完整结构。见图3。

图3 2-BFI对线粒体形态的影响 ×25 000A：对照组；B：NaF组；C：2-BFI组

2.4 2-BFI对线粒体功能的影响与对照组比较，NaF组ATP水平下降(F=1 155，P<0.001)；与NaF组比较，NaF+2-BFI组SH-SY5Y细胞的ATP水平升高(F=1 155，P<0.001。见图4。与对照组相比，NaF组TMRM荧光强度降低(F=15.61，P<0.01)；与NaF组比较，NaF+2-BFI组TMRM的荧光信号升高(F=15.61，P<0.01)。见图5。以上结果提示2-BFI可以改善NaF引发的线粒体膜电位(Δψm)的降低情况。

图4 2-BFI 对ATP水平的影响与对照组比较：***P<0.001；与NaF组比较：###P<0.001

图5 2-BFI 对线粒体膜电位的影响 TMRM染色 ×20A：对照组；B：NaF组；C：NaF+2-BFI组；D：各组荧光强度统计；与对照组比较：**P<0.01；与NaF组比较：##P<0.01

2.5 2-BFI对细胞凋亡的影响TUNEL染色结果显示，与对照组比较，NaF组阳性细胞数量增多，凋亡率升高(F=15.61，P<0.01)；与NaF组比较，NaF+2-BFI组凋亡率下降(F=15.61，P<0.05)。见图6。提示2-BFI可以缓解NaF引发的细胞凋亡。

图6 2-BFI对氟中毒细胞凋亡率的影响 TUNEL荧光染色 ×20A：对照组；B：NaF组；C：NaF+2-BFI组；D：凋亡率统计；与对照组比较：**P<0.01；与NaF组比较：#P<0.05

与对照组比较，NaF组的促凋亡蛋白cleaved caspase-3、Bax含量升高(F=73.76，P<0.001；F=17.73，P<0.01)，抑制凋亡的Bcl-2含量降低(F=39.33，P<0.01)。见图7。与NaF组相比，2-BFI组的cleaved caspase-3、Bax蛋白含量降低(F=73.76，P<0.01；F=17.73，P<0.05)，Bcl-2蛋白含量有所升高(F=39.33，P<0.01)。

图7 2-BFI对氟中毒细胞cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的影响a: cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白条带图；B-D：条带定量分析统计图；a：对照组；b：NaF组；c：NaF+2-BFI组；与对照组比较：**P<0.01，***P<0.001；与NaF组比较：#P<0.05，##P<0.01

3 讨论

氟是自然界分布广泛的元素之一，由于氟化物高度可溶，可通过饮用、食物等介质进入人体，当人体过量摄入氟后，氟化物可以从胃肠吸收进入血液，然后再通过扩散透过生物膜如血脑屏障，从而对中枢神经系统产生影响[7]。据报道，产前暴露于氟的小鼠大脑中的氟含量比未暴露的动物高1.5倍[8]；长期接触氟化物后，工人出现了嗜睡、记忆力减退和注意力障碍等神经精神症状[9]。本研究显示，随着氟化钠浓度的升高，SH-SY5Y细胞增殖受到抑制，细胞存活率不断下降，表明过量的氟会对神经系统产生毒性作用。

2-BFI分子量小，极易透过血脑屏障。2-BFI在小胶质细胞中通过抗脂质氧化作用，稳定线粒体膜电位，减少凋亡蛋白释放，抑制细胞凋亡，对神经损伤产生保护作用[10]。本实验结果显示，应用2-BFI处理NaF损伤的SH-SY5Y细胞，可显著提高细胞存活率，表明2-BFI在地方性氟中毒中有神经保护作用。

线粒体是真核生物进行氧化代谢的重要的细胞器，且一直处在分裂和融合的过程中，线粒体的形态在线粒体正常功能维持过程中起着非常重要的作用[11]。由于大脑需要消耗大量的能量执行功能活动，然而大脑糖酵解能力不足，所以几乎全部依靠线粒体经氧化磷酸化过程产生的ATP来供能，且氟化物易在神经系统积聚，所以神经细胞的线粒体更容易受到氟化物的作用而受到损伤[12]。本研究结果表明，氟化钠作用于SH-SY5Y细胞后，线粒体功能障碍。2-BFI处理24 h之后，有效提高ATP生产量，稳定线粒体膜电位，表明在细胞氟中毒实验中，2-BFI可以通过稳定持线粒体形态和功能发挥神经保护作用。

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，它会对各种不同的毒性刺激做出反应[13]。为了进一步检测2-BFI在细胞凋亡中是否发挥作用，该研究通过TUNEL染色法检测了细胞凋亡率，同时检测了凋亡通路相关蛋白cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2。研究结果显示，2-BFI可降低SH-SY5Y细胞凋亡率，降低Bax和cleaved caspase-3蛋白表达，升高Bcl-2蛋白水平，提示2-BFI的氟中毒神经保护可能与抑制线粒体凋亡途径激活有关。