多酚与蛋白相互作用对蛋白特性影响研究进展

徐梦婷 郝艳宾 齐建勋 丁保淼 陈永浩

蛋白质是人体所需的六大营养素之一，主要存在于畜禽肉、奶类、蛋类、谷物、豆类等食物中。在以蛋白质为主要组分的食品体系中，蛋白质可与碳水化合物、脂肪、无机盐等相互作用，共同决定食品体系的营养特性和感官特性。具有抗氧化活性的酚类物质同样可与蛋白组分形成复合物，使蛋白在结构、功能和营养特性等方面发生变化。

多酚作为植物源食品原料的重要组成成分，广泛存在于核桃、花生、杏仁、栗仁、谷物、豆类中。在很多植源性食品加工中，多酚组分往往需要脱除以减少给产品带来色泽、风味等方面的不利影响。但多酚组分的脱除不仅增加了加工成本，还减少了多酚的营养价值。因此，如何使多酚与蛋白在食品体系中共存是植源性食品加工领域的研究热点。此外，多酚对蛋白特性的影响也受到不少研究者关注。目前，有关多酚与蛋白相互作用的研究主要集中在多酚生物可及性[1]、运载体系功能活性[2]等方面，研究拟在聚焦食品原料体系中多酚与蛋白质之间的相互作用对蛋白质特性的影响，着重阐述多酚与蛋白质相互作用对蛋白结构、加工特性等方面的研究进展，以期为相关食品的研究和开发提供理论依据。

1 多酚与蛋白质相互作用

多酚与蛋白质的相互作用取决于蛋白质和多酚的结构与类型，同时也受温度和pH的影响[3]，多酚和蛋白质的结合机制涉及共价作用、非共价作用、共价—非共价的相互作用。目前用于鉴定蛋白质和多酚相互作用的方法包括荧光猝灭、圆二色谱、傅里叶变换红外光谱、扫描电子显微镜、反相高效液相色谱、电喷雾电离质谱、X射线衍射分析等[4]。

1.1 非共价作用

非共价相互作用一般是可逆的，并且比共价对应物弱。通常，氢键和疏水相互作用是多酚和蛋白质发生非共价结合时的主要作用力[5-6]，离子键在蛋白质和多酚相互作用中起次要作用，如图1所示。例如，Xu等[8]研究表明茶黄素通过疏水相互作用与β-乳球蛋白的Met-107、Asn-90、Asn-88、Leu-87、Ala-86、Lys-69、Lys-60、Val-41和Leu-39残基相互作用。Jiang等[9]观察到新橙皮苷二氢查耳酮和α-乳清蛋白的相互作用主要是依靠疏水相互作用。此外，多酚中的羟基有助于多酚与氨基酸残基的潜在氢结合。例如，表儿茶素(epicatechin，EC)B环上的羟基可通过氢键与唾液中富含脯氨酸的蛋白质中的羰基或酰胺基团结合[10]。儿茶素也可以通过氢键与大豆7S蛋白的Trp328、Gln365、Asn369和Asp334结合[11]。此外，离子键也会参与多酚和蛋白质之间的相互作用。Carnovale等[12]发现，钙的存在会影响αS1-酪蛋白和EGCG之间的相互作用，随着钙离子的加入，去质子化的EGCG可通过离子键与αS1-酪蛋白上的羧基或磷酸基团形成桥接，导致粒径的大幅增加。

图1 蛋白质和多酚的非共价结合[7]Figure 1 Noncovalent conjugation of proteins and polyphenols

此外，研究[13]表明，热力学参数可用于确定多酚和蛋白质之间的结合类型。焓和熵大于零(ΔH>0，ΔS>0)的变化被用来表示疏水相互作用，焓和熵小于零(ΔH<0，ΔS<0)的变化被用来表示范德华力和氢键，而焓小于零、熵大于零(ΔH<0，ΔS>0)的变化被用来表示静电相互作用。例如，胶原蛋白和没食子酸自由能变化(ΔG)全部小于0，表明键合过程是自发的。此外，温度也会影响多酚和蛋白质之间非共价相互作用的类型。据报道[14]，在EGCG与β-乳球蛋白的复合物中，范德华力和氢键作用在60 ℃以上出现，而静电相互作用在85 ℃以上出现。

1.2 共价作用

共价键是多酚和蛋白质之间不可逆结合的结果。多酚与蛋白质之间出现共价键主要是因为醌或半醌自由基的形成。多酚在碱性条件下容易被氧化成半醌自由基，随后半醌自由基重新排列成醌。同时由于醌类物质具有亲电性，它们可以与蛋白质分子上的亲核基团反应，从而形成共价键。猪血浆蛋白水解物与氧化酚类化合物之间，通过C—S或C—N共价键与多肽的巯基或氨基侧链形成二聚体或共价偶联物，诱导了蛋白质的微聚集[15]。因此，巯基和氨基的减少被认为是蛋白质共价修饰的标志。例如，Liu等[16]研究结果表明蛋白质中巯基和游离氨基含量降低且偶联物分子量增加，这证实了乳清蛋白分离物与多酚之间形成了共价键。Yang等[17]研究发现南瓜籽分离蛋白和焦没食子酸之间的共价相互作用依赖于蛋白质的游离氨基，由于氧的存在，焦没食子酸相邻的两个酚羟基被氧化形成邻醌，然后邻醌被蛋白质侧链上的氨基还原，导致蛋白质和焦没食子酸之间形成C—N共价键。此外，在高温条件下多酚和蛋白质也可能发生共价结合[18]。据报道[19]，大蒜素与乳清蛋白b-乳球蛋白在高温处理条件下发生了共价结合，导致蛋白质二级结构发生变化，以及氨基酸暴露程度增加。

多酚的羟基和芳香环的数量决定了其与蛋白质共价相互作用的程度。据报道[20]，与苯甲酸衍生物相比，肉桂酸衍生物与蛋白质会形成更多的共价键。此外，多酚的浓度也会影响与蛋白质共价相互作用的稳定性。例如，低浓度的氧化EGCG由于交联与大豆分离蛋白形成稳定的网络结构，而高浓度的氧化EGCG会使蛋白质反应位点饱和从而阻碍交联[21]。

2 多酚与蛋白质相互作用对蛋白结构的影响

多酚和蛋白质的相互作用会改变天然蛋白质的二级、三级、晶体和微观结构。例如，绿原酸和乳清蛋白分离物非共价结合导致无序结构形成，具体表现为α-螺旋和β-折叠含量减少，β-转角和无规卷曲含量增加[22]。其中氢键是维持α-螺旋结构的主体力量，因此α-螺旋构象的变化与蛋白质疏水区域内氢键与多酚结合有关，而β-折叠含量的减少则与蛋白质疏水性区域展开后蛋白质位点暴露增加有关，特征结构的变化使得蛋白质变得高度无序。但多酚和蛋白质络合也可以诱导蛋白质形成有序结构，例如，樟树籽仁蛋白和酚类化合物通过共价结合导致β-折叠增加(从19.81%增加到21.39%)和无规卷曲减少(从26.07%减少到24.87%)[23]。

有研究[24]表明，与天然蛋白质相比，多酚的浓度、类型、结构和反应pH值会导致多酚—蛋白复合物的二级结构发生变化。例如，单宁酸、没食子酸和EGCG这些多酚主要通过氢键与肌原纤维蛋白(myofibrillar protein，MP)相互作用，使MP的二级结构展开并降低了MP的表面疏水性，而槲皮素和槲皮苷主要通过静电相互作用与MP发生相互作用，从而保留了α螺旋结构，提高了蛋白表面疏水性[25]。pH值对多酚和蛋白质之间相互作用影响主要体现在结合位点上，当pH<7.0时，蛋白质发生解离，导致蛋白质与多酚相互作用的结合位点暴露，因而蛋白质具有更强的亲和力。例如，牛血清白蛋白在pH 4.9 下与单宁酸结合的亲和力高于pH 7.8时的[26]。

荧光光谱法可以广泛用于监测与多酚相互作用后，天然蛋白质三级结构的变化，具体变化表现为蛋白质的最大发射波长发生红移，例如，乳清蛋白分离物的最大荧光发射波长为335.8 nm，与酚类化合物结合后最大发射波长发生了红移，并且与对照组相比，酚类化合物和乳清蛋白分离物的络合物的荧光强度明显降低。这些现象表明，多酚和蛋白相互作用诱导了乳清蛋白分离物三级结构的变化[27]。此外，最大发射波长的红移还可能与芳香族氨基酸残基周围局部环境极性的变化有关。例如，扁豆蛋白与槲皮素、鞣花酸和芦丁的相互作用未出现红移，主要是由于扁豆蛋白的芳香族氨基酸残基极性环境无太大变化[28]。

与天然蛋白质相比，多酚和蛋白复合物具有更高的结晶度、更大的晶体尺寸以及具有更大的片状结构和更光滑的表面。这也进一步证明多酚和蛋白的相互作用会使有序蛋白质结构发生扭曲。例如，单宁酸和没食子酸二者均通过疏水相互作用改变了酪蛋白的微观结构，分别使酪蛋白形成了致密和松散的结构。综上，多酚和蛋白相互作用会对蛋白结构产生至关重要的影响，从而引起蛋白特性的改变。

3 多酚与蛋白质相互作用对蛋白特性的影响

表1例举了一些多酚和蛋白质相互作用的例子及二者相互作用对蛋白特性的影响。

3.1 对溶解性的影响

由表1可知，蛋白质与多酚相互作用可以增加或减少蛋白质的溶解性。例如，绿原酸通过非共价相互作用与酪蛋白和乳清分离蛋白相互作用形成复合物，导致酪蛋白和乳清分离蛋白的溶解度显著提高[29]；MP与槲皮素的偶联暴露了蛋白质内部的疏水氨基酸以及增加了α螺旋含量，在MP中产生更多的疏水位点，导致MP溶解度降低[25]。类似研究[30]还有MP在茶多酚存在下溶解度显著降低，主要是由于茶多酚会导致MP聚集，使最初可溶性MP形成更大的不溶性MP聚集体。因此，单个肌原纤维蛋白分子和多酚之间的相互作用会导致蛋白质的溶解性降低。

表1 蛋白质—多酚相互作用对结构变化和蛋白特性的影响Table 1 Effects of protein-polyphenol interactions on structural changes and protein characteristics

3.2 对凝胶性的影响

由表1可知，多酚和蛋白质的相互作用会引起凝胶性能发生变化。例如，交联明胶—多酚显著增强了凝胶强度，并且使表面更紧凑[38]；酶促反应制备的墨鱼皮明胶和没食子酸的偶联物提高了墨鱼皮明胶的凝胶强度[31]。此外，据报道[39]茶多酚也能促进β-乳球蛋白的变形和聚集性，使β-乳球蛋白凝胶的相对黏弹性降低，并通过较低的胶凝温度和较短的胶凝时间证明了凝胶化的增强。综上，不同类型的蛋白质和多酚相互作用可改善凝胶性能。

然而，Tang等[32]发现，通过自由基移植法制备的迷迭香酸—蛋白质复合物对MP凝胶化产生不利影响。迷迭香酸—半胱氨酸相互作用阻断了MP上硫醇基团形成二硫键交联，并通过破坏蛋白质凝胶化削弱凝胶强度。Jia等[40]研究发现，添加儿茶素后，MP的凝胶强度与对照组相比明显降低，且添加的儿茶素浓度越高，MP凝胶强度下降越显著。

3.3 对热稳定性的影响

由表1可知，多酚和蛋白质的相互作用会引起产物的热稳定性发生变化。例如，糖化MP-EGCG偶联物的肌球蛋白和肌动蛋白表现出高的热变形温度，分别为67.52，72.94 ℃，明显高于对照MP的值，表明EGCG可以提高糖化MP的热稳定性[41]；亚麻籽分离蛋白与酚类化合物的共价结合显著提高了亚麻籽分离蛋白的变性温度，表明复合物热稳定性增加[33]。因此，多酚和蛋白质的相互作用对热稳定性有积极影响。多酚与蛋白质相互作用也会导致焓变化。例如，阿魏酸(ferulic acid，FA)与牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)相互作用后熔点温度升高，表明BSA与FA络合时牛血清蛋白的热稳定性增加[34]。另外，乳铁蛋白与多酚(绿原酸和EGCG)的结合也可以抑制乳铁蛋白在中性pH下的热聚集[35]。因此，动物蛋白和多酚相互作用是增强经过热处理的蛋白质稳定性的潜在技术。

3.4 对乳化性的影响

控制乳化性能的关键因素是蛋白质的表面疏水性，较高的表面疏水性可以增强乳化性和稳定性。多酚和蛋白质的偶联可以增加蛋白质的表面疏水性，从而增强天然蛋白质的乳化性。例如，Abd El-Maksoud等[36]将咖啡酸与β-乳球蛋白在碱性条件下共价偶联，所得的复合物显示出比天然β-乳球蛋白更好的乳化性能；Chen等[15]研究表明当氧化绿原酸和氧化单宁酸加入猪血浆蛋白水解物中时，水解物的乳化活性指数和乳液稳定性指数显著增加，可能原因是猪血浆蛋白水解物与氧化绿原酸的复合物可以迅速吸附在界面上，并在油滴周围形成更厚的界面膜，从而增强乳化性能。然而，多酚和蛋白质相互作用也会对乳液乳化性产生负面影响，但对乳液稳定性产生积极影响。例如，Chen等[42]观察到卵清蛋白和单宁酸的相互作用对蛋白质的疏水基团产生了掩蔽作用，从而降低了卵清蛋白在其等电点附近的界面活性，并通过延缓乳液在卵清蛋白等电点的乳化作用，提高了乳液的稳定性。

3.5 对致敏性的影响

多酚和蛋白质的相互作用可降低蛋白致敏性。食品过敏反应通常由免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，IgE)介导引起[43]，而蛋白质—多酚复合物可通过改变蛋白质结构，允许消化酶破坏IgE结合表位，使抗原表位在消化过程中不被含有过敏原特异性IgE的肥大细胞和嗜碱性粒细胞识别[44]。例如，Wu等[37]研究发现β-乳球蛋白与EGCG和绿原酸结合后β-乳球蛋白的致敏能力降低；Plundrich等[45]用蔓越莓或蓝莓多酚修饰花生蛋白，发现IgE与花生蛋白的结合降低了38%。因此，让多酚与食物中蛋白质相互作用可能是生产低过敏性食物的新思路。

3.6 对抗氧化活性的影响

诸多研究表明，多酚和蛋白质相互作用形成的复合物比天然蛋白质表现出更好的抗氧化活性。例如，Fan等[46]采用自由基诱导的嫁接法制备了BSA和咖啡酸(CA)复合物，BSA-CA复合物的DPPH自由基清除活性显著高于BSA，表明BSA-CA复合物抗氧化活性显著提高；Jing等[47]研究发现通过使用碱性/自由基方法与茶多酚共价结合，蛋清蛋白的抗氧化活性显著提高；乳清蛋白分离物(whey protein isolate，WPI)和4种多酚(EGCG、QC、AG和NC)的偶联物与未修饰的WPI相比，WPI-EGCG、WPI-QC、WPI-AG和WPI-NG的DPPH自由基清除活性分别显著提高了42.26%，34.20%，26.56%，34.41%，即所有偶联物都表现出更高的抗氧化活性[16]。多酚和蛋白质复合物的溶解度变化会影响蛋白抗氧化活性。例如，Pham等[48]报道亚麻籽蛋白分离物(FPI)与酚类化合物(亚麻籽多酚和羟基酪醇)络合显著改变了FPI的溶解度，并且与FPI稳定乳液相比，酚醛配合物乳液具有更高的抗氧化稳定性。因此，蛋白质的抗氧化活性可以通过与多酚形成复合物来增强，从而改善食品的氧化稳定性。

4 结语

多酚与蛋白之间的相互作用可以是非共价的，比如疏水相互作用或氢键等；也可以是在多酚转变成醌或半醌自由基后与蛋白质进行的共价结合。二者之间的相互作用受蛋白质和酚类化合物类型、温度和pH的共同影响，最终引起蛋白质特性的改变。未来在多酚与蛋白相互作用的机理研究方面，进一步明确不同种类的多酚及混合多酚与特定蛋白组分之间的相互作用机制是该领域的重要研究方向，在应用层面，通过多酚与蛋白相互作用研究，调控食品加工和贮运过程中蛋白的特性，为开发多酚与蛋白等多组分共存的食品奠定基础，更好地发挥多酚和蛋白两种组分的有益作用，同时减少在原料处理阶段多酚与蛋白的分离，简化操作单元设置，降低生产成本，这也将是未来发展方向之一。