缬草药材质量标准提升研究

国药集团同济堂(贵州)制药有限公司，贵州 贵阳 550026

缬草为败酱科植物缬草ValerianaofficnalisL.及宽叶缬草ValerianaofficnalisL.var.latfolia Miq.的干燥根及根茎，秋季采挖，除去杂质，阴干，为《贵州省中药材、民族药材质量标准》[1]收录的贵州省少数民族用药，具有理气止痛、祛风除湿、宁心安神的功效，用于脘腹胀痛、风湿痹痛、腰膝酸软、失眠等。缬草分布于我国东北至西南的广大地区。生于海拔2500 m以下山坡草地、林下、沟边，在西藏可分布至海拔4000 m[2]。宽叶缬草分布于安徽、江苏、浙江、江西等省区，贵州主要分布于松桃、印江、沿河、剑河、镇宁、岑巩、道真、绥阳、湄潭、凯里、正安、桐梓等地。缬草主要含环烯醚萜类、挥发油、生物碱、木脂类、黄酮类、氨基酸等化学成分[3-6]，具有镇静催眠、抗抑郁、抗惊厥和癫痫等药理作用[7-14]。在欧美作为一种温和的镇静安神催眠药使用[13]。但国内缬草药材质量控制方面的研究较少[14]，现行质量标准仅收载性状、鉴别项。因此，贵州省药品监督管理局将缬草纳入《贵州省中药材、民族药材质量标准研究》计划，笔者改进薄层色谱鉴别方法，增加水分、总灰分、浸出物检查，采用气相色谱法测定乙酸龙脑酯含量，为质量标准修订提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 GC-14C型气相色谱仪(岛津)；SB25-12DTS型数控超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；CX41型显微镜(OLYMPUSCORPORATION)； Scopelmage 9.0 图像采集软件(宁波永新光学股份有限公司)； E201型紫外可见分光光度计(Thermo)、ML204电子分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)、纯水仪(Genie-5 Rephile)。

1.2 材料 乙醇(批号：20170901)、无水乙醇(批号：20170201)购自重庆川东化工(集团)有限公司；乙酸龙脑酯对照品(110759-201105)、水杨酸甲酯对照品(110707-201413)购自中国食品药品检定研究院。水为自制纯化水。 10 批缬草(编号S1～S10)由国药集团同济堂(贵州)制药有限公司种植部提供，经贵州中医药大学药学院何顺志教授鉴定为败酱科植物缬草ValerianaofficnalisL.及宽叶缬草ValerianaofficnalisL.var.latfolia Miq.的干燥根及根茎。具体信息见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 水分含量测定 精密称取10批缬草药材粉末(过二号筛)约20 g，按照2020年版《中国药典》[15](四部)通则“0832水分测定法”的第四法(甲苯法)进行测定，每批样品平行测定两份，取平均值。结果，10批样品中水分的含量最低为9.81%，最高为13.60%，平均值为11.18%，以平均测定值的120%设限，为13.42%，故建议将水分标准定为不得过13.00%。缬草药材水分含量测定结果见表2。

2.2 总灰分含量测定 精密称取10批缬草药材粉末(过二号筛)各约2.5 g，按照2020年版《中国药典》[15](四部)通则“2302灰分测定法”的第一法(总灰分测定法)进行测定，每批样品平行测定两份，取平均值。结果，10批样品中总灰分的含量最低为9.81%，最高为11.77%，平均值为10.94%，以平均测定值的120%设限，为13.13%，故建议将总灰分标准定为不得过13.00%。缬草药材总灰分含量测定结果见表2。

2.3 浸出物含量测定 取10批缬草药材粉末(过二号筛)各约3 g，按照《中国药典》[15]2020年版四部通则2201醇溶性浸出物测定法项下热浸法测定，用50%乙醇作溶剂，每批样品平行测定两份，取平均值。结果，10批样品中浸出物最低值为17.5%，最高值为21.2%，平均值为19.75%，以平均值的80%设限，为15.8%，故建议将浸出标准定为不得少于16.0%。缬草药材浸出物含量测定结果见表2。

表2 缬草水分测定结果

2.4 乙酸龙脑酯含量测定

2.4.1 校正因子测定 精密称取水杨酸甲酯对照品适量，加无水乙醇制成每1 mL含2.8 mg的溶液，摇匀，作为内标储备溶液。另取乙酸龙脑酯对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1 mL含1.0 mg的溶液，作为对照储备液。精密吸取 5 mL 置50 mL量瓶中，精密加入内标储备液5 mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取1 μL，注入气相色谱仪，测定，计算校正因子。

2.4.2 内标溶液制备 精密吸取5 mL内标储备液置50 mL量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度[16-17]，即得内标溶液。

2.4.3 供试品溶液制备 取供试品约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加75%乙醇25 mL，称定重量，超声处理(功率250 W，频率33 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用75%乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液2 mL与内标溶液2 mL，摇匀，即得供试品溶液。

2.4.4 色谱条件 以聚乙二醇20000(PEG-20M)为固定液的毛细管柱(柱长为30 m，内径为320 μm，膜厚度为0.5 μm)为色谱柱。载气为高纯度氮气(纯度>99.999%)，流速 0.8 mL/min；柱温为140 ℃；进样口温度为 200 ℃；FID检测器，检测器温度为250 ℃；分流进样，进样量1 μL，分流比为10∶1。理论板数按乙酸龙脑酯峰计算应不低于2000。色谱图如图1所示。

图1 缬草气相色谱图

2.4.5 线性关系 精密称取水杨酸甲酯对照品适量，加无水乙醇制成每1 mL含2.8084 mg的溶液，摇匀，作为内标储备溶液。另取乙酸龙脑酯对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1 mL含 1.2167 mg 的对照品储备溶液。分别精密吸取乙酸龙脑酯对照品储备溶液1 mL、2 mL、3 mL、5 mL、10 mL、15 mL于 25 mL 量瓶中，并分别精密加入内标储备溶液 2 mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，分别制成每1 mL中含48.668 μg、97.336 μg、146.004 μg、243.340 μg、486.680 μg、730.020 μg的系列对照品溶液，依次吸取1 μL，注入气相色谱仪，按“2.4.4色谱条件”项下方法测定峰面积。以峰面积为纵坐标、乙酸龙脑酯对照品进样量为横坐标进行线性回归，得回归方程为：Y=0.4493X+1.0979(R2=1.0000)，表明乙酸龙脑酯在48.668～730.020 μg/mL范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

2.4.6 精密度试验 精密吸取乙酸龙脑酯(97.336 μg/mL)对照品溶液， 按“2.4.4” 项色谱条件连续进样测定6次， 记录色谱峰面积。结果乙酸龙脑酯峰面积的RSD为0.40%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.4.7 重复性试验 精密称取已知含量的同一批号的样品6份(S4)，每份约1.5 g，按“2.4.3” 项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.4.4”项色谱条件下进样测定，6次乙酸龙脑酯峰面积的RSD为1.88%，表明该方法重复性良好。

2.4.8 稳定性试验 取“2.4.7 重复性试验”制备的供试品溶液，按“2.4.4项下色谱条件”，分别于1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h测定乙酸龙脑酯峰面积。结果表明，乙酸龙脑酯面积的RSD为1.36%，表明乙酸龙脑酯溶液在室温下6 h内稳定性良好。

2.4.9 加样回收率试验 精密称取已知含量样品(S4，含量为0.180%)，混匀，取6份，每份约0.75 g，置25 mL具塞锥形瓶中，每份分别精密加入乙酸龙脑酯对照品溶液1 mL(1.2167 mg/mL)，按“2.4.3”供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，在“2.4.4”项色谱条件进样测定，计算乙酸龙脑酯回收率，乙酸龙脑酯平均回收率为99.16%，RSD=0.46%，表明方法的准确度较好。结果见表3。

2.4.10 样品含量测定 取10批缬草药材，按“2.4.3”供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“2.4.4”项下色谱条件进行测定乙酸龙脑酯含量，结果见表4。

表3 加样回收率实验结果

表4 不同批次缬草含量限度测定

根据测定结果，10批缬草药材含量范围为：1.35～2.06 mg/g，平均值为1.84 mg/g，最低值为1.35 mg/g，最高值为2.06 mg/g，以平均值的80%设限，为1.47 mg/g，考虑到各种药材原料含量的波动，故建议将缬草中乙酸龙脑酯含量限度标准暂定为不得少于1.5 mg/g。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备 根据化学成分的溶解性，分别对提取溶剂(甲醇、乙醇、乙酸乙酯)，提取溶剂浓度(25%、50%、75%、95%)，提取方法(超声、回流)，提取溶剂用量(15 mL、25 mL、35 mL)，提取时间(20 min、30 min、40 min)，样品取样量(1.0 g、1.5 g、2.0 g、2.5 g)等条件进行考察，结果表明，以本文中制备方法制备的供试品溶液峰面积最大。

3.2 色谱条件 分别选择对进样口温度(195 ℃、200 ℃、205 ℃)，检测器温度(245 ℃、250 ℃、255 ℃)，柱温(135 ℃、140 ℃、145 ℃)，流速(0.5 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.5 mL/min)，分流比(5∶1、8∶1、10∶1、15∶1)及不同厂牌(Thermo和Agilent)进行耐用性试验考察。结果表明，按照本文确定的色谱条件进行试验，在不同的进样口温度、不同的检测器温度、不同的柱温及不同厂牌的色谱柱的小范围变动情况下测定结果稳定，重现性好，表明本试验建立的方法耐用性强。

3.3 浸出物测定方法考察 在进行浸出物测定时，对浸出物测定方法(冷浸法、热浸法)，浸出溶剂种类(乙醇、甲醇、水)，浸出溶剂(乙醇)浓度(25%，50%，75%，95%)进行考察，结果，使用本文的浸出方法和溶剂浓度测定时，浸出物含量最高。

3.4 药材基原确定 宽叶缬草为贵州省苗族习用药材，是败酱科植物缬草的一个变种， 2003版《贵州省中药材、民族药材质量标准》以宽叶缬草为药材名，仅收载缬草变种宽叶缬草，根据对贵州民间走访和对缬草资源的调查以及原植物鉴定，贵州民间将缬草和宽叶缬草同时作为药用，且均称呼为缬草。而且经查阅《科学的民间药草》《植物学大辞典》《全国中草药汇编》《中华本草》《陕西中草药》等本草专著，均将宽叶缬草和缬草列为药材缬草的原植物，故本次标准修订将2003版《贵州省中药材、民族药材质量标准》原药材名宽叶缬草更名为缬草，将植物缬草ValerianaofficnalisL.作为药材缬草的来源之一。

3.5 指标成分选择 缬草中含挥发油0.5%～2%，挥发油中乙酸龙脑酯含量一般超过30%，有的宽叶缬草中乙酸龙脑酯甚至高达60%[18]，且缬草挥发油药理作用显著，应用前景广阔，故选择缬草中含量高且药理作用显著的乙酸龙脑酯作为质量控制的指标性成分。

综上，研究增加缬草药材质量标准中水分、灰分、浸出物限度检查，采用气相色谱法测定缬草中乙酸龙脑酯含量，完善缬草药材质量控标准，所建立的检查限度合理，含量测定方法专属性较强，精密度较高，重复性较好，可为缬草药材质量标准修订提供参考。