HPLC波长切换联合梯度洗脱法同时测定舒肝颗粒(广西标准)的活性成分含量

蓝 远1 梁 芳* 阳春苗 盘 涌 梁玉琼

1.葫芦娃药业集团广西维威制药有限公司，广西 南宁，530031；2.广西中医药大学赛恩斯新医药学院，广西 南宁，530222

舒肝颗粒(广西标准)由夏枯草、虎杖、茵陈等九味药材配伍而成，功效为疏肝开郁、清热解毒、化湿健脾，临床上主要用于治疗黄疸型及非黄疸型急性肝炎，深受患者好评，在广西有广阔的市场前景。方中夏枯草、虎杖、茵陈、柴胡、蒲公英均有保肝作用[1-5]，在保护肝细胞、改善肝功能、减轻肝损伤、降低脂肪肝、抗肝纤维化方面具有良好的疗效[6-10]。君药夏枯草所含活性成分迷迭香酸能够抑制肝星状细胞的激活和增殖分化，缓解肝纤维化；臣药虎杖所含活性成分虎杖苷通过降低TNF-α、肝脂质的过氧化和SREBP-1c介导的脂质生成来保护肝脂肪变性；虎杖所含另一活性成分大黄素等蒽醌类化合物可抑制乙型肝炎抗原阳性，多被用于治疗急性黄疸型肝炎和慢性肝炎；臣药茵陈所含活性成分绿原酸可以有效抑制四氯化碳诱导的急性肝损伤及肝纤维化、降低甲氨蝶呤诱导的肝毒性[11-14]，故本研究以迷迭香酸、虎杖苷、大黄素和绿原酸为检测指标。由于4个活性成分分属不同类化合物，它们的最大吸收波长不一样，采用单一波长检测就会造成有的成分吸收峰比较小甚至出现倒峰，故本实验采用HPLC波长切换联合梯度洗脱法进行含量测定，利用不同时间段的最佳检测波长可以保证4个活性成分能够同时出峰且响应值最大，分离效果佳，为提高原质量标准提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 XS105DU十万分之一分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；Agilent1200(DAD/ELSD)高效液相色谱仪及色谱工作站(美国安捷伦科技有限公司)；YH系列电热套(江苏近湖教学仪器厂)；RV-5A型旋转蒸发仪(凯斯特生物化学仪器有限公司)；超声波清洗机(上海比朗仪器有限公司)。

1.2 对照品与试剂 绿原酸对照品(批号：110753-201817，供含量测定用，含量以96.8%计)、虎杖苷对照品(批号：111575-201603，同上，含量以87.3%计)、迷迭香酸对照品(批号：111871-201706，同上，含量以90.5%计)、大黄素对照品(批号：110756-201512，同上，含量以98.7%计)，所有对照品均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈购买于Fisher公司，液相用水使用娃哈哈纯净水。

1.3 药材 夏枯草(批号：18102001)、茵陈(批号：18022701)、蒲公英(批号：18082202)、甘草(批号：18102801)、苍术(批号：18092504)、北柴胡(批号：18102202)、虎杖(批号：18051501)来源于广西宝正药业有限公司。马兰草、白茅根购自广西玉林药市，经我院中药鉴定教研室苑敏副教授鉴定为马兰草系菊科植物马兰头Kalimerisindica(L.)的干燥全草，白茅根系禾本科植物白茅ImperatacylindricalBeauv.var.major(Nees)C.E.Hubb.的干燥根茎。

2 舒肝颗粒的制备

按处方量称取夏枯草100 g和虎杖75 g，加12倍量60%乙醇回流提取2次，每次80 min，滤过，合并醇提液，回收乙醇，浓缩至比重为1.26(80 ℃ 热测)的清膏，备用。称取茵陈、蒲公英、马蓝草、柴胡各75 g和苍术、白茅根、甘草各 50 g，加入18倍量水,浸泡40 min后，煎煮2次，每次1.3 h，滤过，合并水提液，浓缩至比重为1.26(80 ℃热测)的清膏，与上述醇提清膏合并，混匀。以清膏1份，加糖粉3份和糊精1.5份混匀，制成颗粒，干燥，即得。按上述方法制备三批舒肝颗粒，批号分别为：20200701、20200702、20200703。

3 含量测定

3.1 色谱条件与系统适用性试验 固定相为CAPCELL PAK C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，设定梯度洗脱程序为：0～20 min，10%A；20～32 min，10%→20%A；32～40 min，20%→35%A；40～45 min，35%→70%A；45～55 min，70%→80%A；55～60 min，80%→90%A；检测波长为0～20 min，327 nm，20～60 min，306 nm；流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL；柱温为30 ℃。分别取供试品溶液和混合对照品溶液进样分析，结果显示，供试品溶液HPLC图中绿原酸、虎杖苷、迷迭香酸、大黄素4个成分的保留时间与混合对照品溶液HPLC图保留时间一致，分离度分别为18.74、15.77、3.36、22.70，理论塔板数分别为11246、398312、859974、1461240，结果如图1、图2所示。

3.2 混合对照品储备液的制备 精密称定绿原酸对照品3.2 mg、虎杖苷对照品5.3 mg、迷迭香酸对照品3.4 mg、大黄素对照品2.1 mg，置25 mL量瓶中，加60%乙醇适量，超声使溶解，再加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，备用。混合对照品储备液浓度为绿原酸123.9 μg/mL、虎杖苷 185.1 μg/mL、迷迭香酸123.1 μg/mL、大黄素80.64 μg /mL。

1.绿原酸；2.虎杖苷；3.迷迭香酸；4.大黄素

图2 供试品溶液HPLC图

3.3 供试品溶液的制备 取舒肝颗粒(批号：20200701)适量，研细，混匀，约取4 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加60%乙醇适量，超声处理30 min，放冷，再用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.4 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品储备液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置10 mL量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，制成6个梯度浓度的混合对照品溶液，进样测定，记录色谱图。以对照品浓度μg·mL-1为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线并计算回归方程。结果见表1。

表1 线性关系考察结果

3.5 精密度试验 精密吸取“3.2”项下的混合对照品储备液2.0 mL，置10 mL量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液，浓度为绿原酸24.78 μg /mL、虎杖苷37.02 μg /mL、迷迭香酸24.62 μg /mL、大黄素16.13 μg /mL。连续进样6次，绿原酸、虎杖苷、迷迭香酸、大黄素的峰面积平均值分别为453.2、1220.0、285.7、177.4，RSD值分别为0.33%、0.14%、0.04%、0.08%。

3.6 稳定性试验 取同一份舒肝颗粒(批号：20200701)供试品溶液，室温下放置，分别于 0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样测定，4种成分峰面积平均值为583.7、1090.0、310.2、170.8，RSD值为0.08%、0.07%、0.21%、0.11%。

3.7 重复性试验 取同一批次舒肝颗粒(批号：20200701)6份，每份4 g，精密称定，依法制备成供试品溶液，进样测定，得4种成分的含量平均值为0.3783 mg/g、0.4127 mg/g、0.3370 mg/g、0.1955 mg/g，RSD值为0.51%、0.25%、1.09%、1.20%。

3.8 加样回收率试验 精密称定已知含量的舒肝颗粒(批号：20200701)6份，每份2 g，置 50 mL 量瓶中，分别精密加入混合对照品溶液 0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，按“3.3”项下方法制备成供试品溶液，进样分析，计算平均回收率和RSD，结果均符合要求。详见表2。

表2 加样回收率试验结果

表2(续)

3.9 样品测定 取舒肝颗粒三批(批号：20200701、20200702、20200703)各4 g，精密称定，依法操作，进样分析。结果见表3。

表3 含量测定结果 (mg/g，n=3)

4 讨论

4.1 指标成分的选择 舒肝颗粒(广西标准)由九味药材配伍而成，夏枯草为君药，清肝泻火、散结消肿，配以茵陈、虎杖为臣，辅以清肝胆湿热，退黄疸之效。柴胡疏肝解郁退热，马蓝草、蒲公英清热解毒抗炎、消肿散结，苍术健脾燥湿，白茅根凉血清热利尿，使得湿热从小便去，作为使药的甘草养阴生津、益气和胃，与诸药合用，共奏疏肝开郁、清热解毒、健脾化湿之功效。本研究参考《中国药典》2015年版一部药材质量标准[15]，选取处方中的君药夏枯草活性成分迷迭香酸，臣药茵陈活性成分绿原酸及虎杖活性成分虎杖苷、大黄素，采用HPLC法建立该药品的定量方法，以期更加全面地评价舒肝颗粒的内在质量。

4.2 供试品溶液提取方法考察 根据待测成分的理化性质及溶解度，分别考察超声提取法和回流提取法两种提取方式，HPLC色谱图显示回流提取法产生的杂质峰较多，会干扰到待测成分的分离，故选择产生杂质峰较少的超声提取法。再分别考察提取时间20 min、30 min、40 min、60 min下的提取率，实验结果表明超声提取30 min时提取率较高且时间较短，故供试品溶液的提取方法选择超声提取30 min。

4.3 检测波长的选择 切换波长法是高效液相色谱法中同时检测多组分含量测定时常用的一种方法。本研究测定绿原酸、虎杖苷、迷迭香酸、大黄素4个组分的最大吸收波长分别为327 nm、306 nm、330 nm、254 nm，采用单波长检测时不能使待测组分的响应值达到最大，甚至在检测波长为254 nm时虎杖苷峰和迷迭香酸峰呈现倒峰，在检测波长为330 nm时大黄素峰呈现倒峰，因此必须采用切换波长法才能保证4个组分能同时出峰。经过预实验多次摸索，最终确定在0～20 min检测波长为327 nm，20～60 min检测波长为306 nm，可以使4个组分在高灵敏度下被检出，同时还可以使不需要检出的成分或干扰成分出峰较小，甚至不出峰，从而有效提高检测结果。

4.4 流动相的选择 舒肝颗粒所含药材成分多且化学性质多样，采用HPLC恒流测定无法将待测成分有效分离，故选择梯度洗脱法同时测定4个成分的含量。本研究先后考察不同的流动相系统对待测成分的分离效果，比较色谱峰峰形、分离度、分析时间长短、基线漂移及杂质峰干扰等情况后，最终确定用乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱60 min作为HPLC梯度洗脱法，得到的色谱图符合系统适用性试验要求。

5 小结

舒肝颗粒(广西标准)原名为舒肝冲剂，收载于广西药品标准(一九八四年版)，标准编号为桂Q/WS-1-380-84。原质量标准因受到历史条件局限无法进行含量测定检测项目，不利于控制其内在质量，本研究是在原质量标准基础上增加了该药品的定量方法，保障了临床用药安全，可用于舒肝颗粒(广西标准)的质量控制，预期舒肝颗粒(广西标准)能够进一步被《中国药典》收载。提升原质量标准为开发利用具有广西特色民族中药制剂提供新思路。