茶关联的氟素含量测定技术研究进展

涂云飞

（1. 浙江省茶资源跨界应用技术重点实验室，浙江 杭州 310016；2. 中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江 杭州 310016）

氟（原子序数9）作为动植物及人体必需的微量元素，在自然界一般存在于萤石（CaF2）、冰晶石（Na3(AlF6)）、氟磷灰石中，排在地壳所有元素含量的第13位［1,2］（0.08%，w/w），位于元素周期表中第二周期第VII族，电负性达4.0，是氧化性最强的非金属元素。目前，国际上尚无每人每日安全摄氟量的统一标准，但一般认为，1岁、2岁、12岁及成年人的氟素每日摄入量［3］建议分别不高于0.1～1、0.5～1.5、2.5、3.5 mg。而人体所需要的氟离子量有65%来自饮用水、35%来自食物，适量的氟离子有益于人体健康，可有效的防止蛀牙的发生，并且氟离子还可通过取代羟基硅钙石（Ca10(PO4)6(OH)2），形成结构稳定性的氟磷灰石（Ca10(PO4)6OHF和Ca10(PO4)6F2）晶体来改善骨矿化；但过量的氟，轻则会障碍人体牙釉质形成，牙齿表面出现斑点，引起氟斑牙病，重则会对人体蛋白质和酶系统的生物活性产生负面影响，如氧化应激、基因表达改变、磷酸酶与免疫系统抑制、和人体过早衰老等，并进一步导致人体骨骼氟化，患上氟骨病。同时，高氟离子饮用水还可能引起膀胱、肺脏与神经系统的损伤，并与骨肉瘤、骨癌、血癌、尿石症（肾结石）发病率、出生率下降呈正相关性，从而严重危害人体的身心健康［4－6］。

茶树（Camellia sinensis(L.) O. Kuntze）对氟具有较强的富集效应，叶子中含量随其成熟度的增加而递增。茶树中的氟素主要来自土壤、茶园投入品（肥料与农药）、空气及灌溉水，同时低于茶树适宜生长的土壤pH（5～5.6）环境也更有利于其累积氟离子［7］。另外，因为茶能够解腻，边疆人民有宁可三日无肉，不可一日无茶，其饮茶习惯与其大量食肉有很大的关系，但长期大量饮用由成熟度高的叶子加工成的砖茶，易引起边疆人们饮茶型氟中毒，因此建立和完善茶叶中氟含量的检测体系，准确测定产品中的氟离子含量对于了解与调控砖茶中氟离子含量显得尤为迫切，意义重大。目前，各国学者针对氟素的检测进行了大量深入的研究与总结［8,9］，主要方法包括：氟离子选择电极法、极谱与伏安法、传统原子吸收光谱法、高分辨连续光源原子吸收光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法、分子络合比色法、离子色谱法等。鉴于氟素分析方法的不断报道与技术的进步，笔者进一步对其进行了总结梳理，供行业参考。

1 电化学法

1.1 离子选择电极电位法

自1906年Cremer［10］发现玻璃膜在不同组分的溶液中具有不同的电势值现象以来，针对H+、pH、F-、Cu2+等离子选择电极产品得到了广泛的应用［11］。氟离子选择电极是由掺有0.1%～0.5%EuF2和1%～5% CaF2的LaF3单晶膜切片与内参比电极（Ag-AgCl）而组成，如图1所示。其原理是LaF3作为阴离子导电的固态电解质中晶格中有空穴，在晶格上的氟离子可移入晶格邻近的空穴而导电，纯LaF3单晶的电导率电阻为5～10 MΩ，在单晶中加入Eu2+、Ca2+后使LaF3晶体中产生相同数目的F-空位，从而在室温下比纯晶体具有小的体电阻［12］。体电阻降低，制成电极的内阻愈小，缩短电极的响应时间、增加电位稳定性和降低对测量仪器输入阻抗的要求，从而能够快速测定溶液中的氟离子浓度。并且当氟离子选择电极插入一定浓度的氟离子试液中时，电位差随溶液中氟离子活度的变化而改变，电位变化规律符合能斯特方程，即电极电位对氟离子产生选择性的对数效应。

图1 氟离子选择电极组成示意图Fig. 1 Schematic fluoride ion-selective electrode device

实践中已被广泛应用的氟离子选择性电极，虽然具有设备成本低、操作简单、检测快速等特点，但其电极电位易受环境因素（如pH值、金属离子浓度）影响而漂移。且氟含量越低，pH值影响越大，另外待测溶液pH值过低会促使氟离子形成HF而挥发损失［13］，过高则会促使氟化镧晶体在溶液中的溶解使测定结果偏高，故测量溶液的一般适宜酸度为pH 5～6。1966年Frant［14］报道了使用膜电极法测定茶叶中氟离子浓度，但氟离子易与样品中其他元素形成络合物［15,16］，如具有富集氟、铝特性的茶叶，其茶水中干扰其测定精度的离子如较大浓度的Al3+和较小浓度的Fe2+、Ca2+、Mg2+等。总离子强度缓冲液（Total Ionic Strength Adjustment Buffer Solution，TISAB）是较为常用的干扰离子屏蔽试剂，通常选用乙酸-柠檬酸钠（国标法），盐酸-柠檬酸钠，柠檬酸-柠檬酸钠来进行配制，其中柠檬酸钠可使铁氟、铝氟络合物的络合物断裂，形成稳定的柠檬酸铁、柠檬酸铝，从而释放氟离子，但过高的总离子强度缓冲液易导致氟电极中毒［17］。除此以外，屏蔽试剂［18－21］，如柠檬酸类、CDTA（t-l,2-diaminocyclohexane-N,N,N',N'-tetraacetic acid）、TISAB、DTPA（diethylenetriamine-N,N,N',N",N"-pentaacetic acid）、TTHA（triethylenetetramine-N,N,N',N",N"',N'"-hexaacetic acid）等，也应用至氟离子电极测定中。另外，溶液酸度不仅对氟电极产生影响，也能显著影响氟铝络合物的稳定性［22－25］，改变溶液pH及溶液离子强度一定程度上可以避免络合反应所带来的干扰，如在pH 6条件下，氟离子只有21.35%和60.40%的AlF2+和AlF3+络合物，而在pH 8～9时，所有氟化物都以自由阴离子状态存在。

1.2 伏安极谱法

由捷克化学家海洛夫斯基于1922年提出的伏安极谱法，是以连续的汞滴（最大直径可达0.5 mm的汞滴通过内径约为0.05 mm的毛细管流出）作为工作电极，大面积的甘汞电极（与汞滴相比，其表面积高上百倍）为参比电极，及辅助电极铂，对试液样品电解，因工作电极比参比电极表面积小，相同电流下，电流密度则大幅度升高，从而在电解过程中，发生的氧化还原反应（汞可以和许多金属生成汞齐），易产生极化的电流电压信号（还原峰），并据此进行定性和定量分析的方法［26,27］。氟离子因具有强的电负性，难以发生氧化还原反应，但其与能够在电解过程中发生氧化还原反应的金属络合物发生配位反应，从而影响其电流信号，达到间接测定溶液中氟浓度的目的。其所形成的络合吸附波在经典极谱上不容易观察到，需以导数单扫描示波极谱，来提高其灵敏度和分辨率。

以络合物吸附波的金属络合物配体为研究对象，如李南强以La3+-茜素络合剂（Alizarin Complexone, ALC）-F-三元络合物［28］，在六次甲基四胺缓冲液中的极谱波非常灵敏，然而反应时间2-7小时。姚胜来等进一步研究表明［29］：Ce3+-ALC-氟络合剂体系在pH 4.9时，混合液放置40 min，无需通氮除氧，用线性扫描溶出伏安法测定氟离子，即可得稳定的测定结果，峰电流与氟离子浓度有正比关系，Pr3+/Ce3+-ALC-F-丙酮体系［30,31］也应运至氟素测定。同时在Ce3+-ALC-F-络合体系［32］中，为避 免A13+、Cu2+、Fe3+、Cd2+、Zn2+、Mn2+等 金属 离子的干扰，在pH 6.0时，使用8-羟基喹啉可使大多数金属离子产生沉淀而与F-分离，并以四氯化碳萃取过量的8-羟基喹啉，其氟离子检出限为6 μg·g-1。另有以聚乙二醇作为稳定波形与信号增敏剂，利用氟对Zr4+-水杨基荧光酮-十六烷基三甲基溴化铵［33,34］三元络合体系的竞争抑制，用单扫描极谱法测定多样品中的痕量氟，并使氟离子浓度在16～800 μg·L-1的范围内呈线性关系，样品氟素回收率为91.04%～110.8%。

2 光谱法

2.1 原子光谱法

氟是电负性最强的元素，其电离能达17.42 eV，其响应波长在真空紫外区域（＜100nm），元素干扰造成的噪音影响原子吸收光谱与电感耦合等离子体发射光谱仪直接测定。但有学者通过添加其它元素与氟素形成双原子分子，在气化条件下，以高分辨连续光源-原子吸收光谱仪（High-Resolution Continum Source Atomic Absoprtion Spectrometer，HS-CS-AAS）实现间接检测，同时可以获得从真空紫外到近红外的整个波长范围内的任何旋转超精细结构线。Silvane［35］与Ozbek［36］利用其原子吸收光谱法，加入20倍摩尔数的Ca2+，再通过蒸发CaF2进行测定，采用电热蒸发高分辨率分子吸收光谱法测定茶叶中的氟。GaF与SrF双原子分子也被应用于检测溶液中的氟素含量［37-40］，且300 mg·L-1的Al2+、Mg2+、Ca2+等阳离子，及10.0 mg·L-1的Cl-、NO3-、SO42-、PO43-等水中常见阴离子没发现明显的干扰信号。除以原子吸收光谱进行间接测定外，Okamoto等［41］人基于Ce3+与氟素形成CeF3沉淀的等离子体原子发射光谱（Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry，ICP-AES）间接测定氟化物，其主要是将微体积的水样品溶液（放置少量四甲基氢氧化铵于汽化器系统中，以抑制干燥阶段可能发生的氟化物损失）转化为原子或分子蒸汽，并将产生的蒸汽输送到等离子体中测定，但四甲基氢氧化铵对呼吸与神经系统毒性较强，应引起重视，并且该法目前在茶叶中的应用较少有文献报道。

2.2 紫外可见分光光度法

BELCHER R等［42］首先通过实验发现红色的Ce3+-ALC络合物，在加入具有孤对电子及强的金属配位能力的氟离子后，形成三元络合的蓝色化合物，从而首次实现光度法测定氟离子含量，检出下限为0.05 mg·L-1，该反应体系不足之处在于显色反应速度较慢，同时，杂元素对显色有一定的干扰，目前该体系（稀土元素、茜素与氟三元体系）在极谱法中得到了广泛应用。在茶叶氟素测定体系中，氟离子可对锆(Ⅳ)-水杨基荧光酮-溴化十六烷基三甲铵三元络合物形成竞争抑制［43］，从而建立茶叶中痕量氟的抑制分光光度定量方法，其测定线性范围为0.08～0.45 mg·L-1。

此外，氟离子还能够与各金属配合物显色体系进行反应，从而实现氟离子浓度的间接测定。各体系中主要金属离子包括钍、铝、锆与铁，及其对应的配体主要有溴甲酚橙［44］、偶氮胂I（CAS：520-10-5，高毒性）［45］、铬天青S［46］、孔雀石绿（CAS：569-64-2有毒的三苯甲烷类化学物）［47］、5-(2-羧基苯偶氮)-8-羟基喹啉［48］、2-(对磺基苯偶氮)-1,8-二羟基萘-3,6-二磺酸（CAS：23647-14-5）［49］、甲基百里酚蓝（CAS：1945-77-3）［50］、二甲酚橙（CAS：1611-35-4）［51,52］、半菁染料（实验合成品）［53］、半二甲酚橙（CAS：19329-67-0）、水杨酸［54］等。

大部分金属配合物体系在氟离子加入后，使原有的有机络合物配体呈游离状态，虽然色泽上发生改变，但其扫描光谱与原有光谱没有明显位移，即有较多的重叠，存在定量不精确性问题，PETRENKO D B等［55］最近发现将处理过的没食子蓝与锆反应形成的物质在氟离子的存在下会发生较为明显的位移，从而为实现精确的定量奠定基础，在0.03～2 mg·L-1范围内线性较好。检测氟离子的紫外可见分光光度法特定体系还有待进一步深入研究。

3 色谱法

3.1 离子色谱法

离子色谱法具有检测样品中阴离子（氟离子、氯离子、硝酸根离子、磷酸根离子、硫酸根离子等）与金属阳离子的能力，所需样品量少（微升级），且快速准确。按交换方式的差异，可分为离子交换色谱法、离子排斥色谱和离子对色谱法。其中以高效离子交换色谱法（HPIC）报道氟离子检测的文献偏多，但茶叶中的有机酸与氟离子在HPIC中的出峰时间接近，进样前需要对样品进行纯化处理，才能进行HPIC分析。茶叶样品前处理方法主要有：灰化处理［56］、氧瓶燃烧处理［57,58］与扩散吸收提取处理［59,60］。蔡梦华等［56］以水浴蒸干茶叶水提液（2.5～5 g的茶叶加100 g·L-1的Mg(N03)25.0 mL和100 g·L-1的NaOH 0.5 mL，浸泡30 min），低温炭化，放进马福炉600℃灰化6 h，冷后取出，每个样品用纯水分次洗涤坩埚，合并洗液定容，但灰化蒸馏是在一个敞开的体系对茶叶样品进行前处理，因此，氟素在灰化过程中，会损失一部分，从而导致检测结果偏低。而在密闭的体系进行的氧瓶燃烧法，在释放茶叶中的氟素的同时，能够最大程度地避免茶叶中氟素的损失，此外，通过氧瓶燃烧处理茶叶试样后，试样溶液中的检测基体得到了较好的净化［57］，蔡荟梅等［58］以柱容量较高的IonPacASl9色谱柱，并以5～40 mmol·L-1KOH梯度淋洗，流速为1.0 mL·min-1，茶叶中氟离子检测的线性范围为0.05～30 mg·L-1，最低检测限5 μg·kg-1，但氧弹燃烧需特定的装置，从而限制其推广应用。而扩散吸收提取处理，主要是利用硫酸与样品中氟化物反应产生氟化氢气体被扩散盒盖中氢氧化钠或Na2CO3吸收的原理［59,60］，可以很好地去除样品中其他物质带来的干扰，并且操作简单，氟损失小，唯一不足是吸收液中的碱会对离子交换产生干扰，其可通过氢柱来去碱。另有以离子排斥色谱法［61］进行氟素测定，该方法基于Donnon膜排斥效应，及电离组分受排斥不被保留，而弱酸则有一定保留，可直接将氟化物与有机酸分离。

3.2 气相色谱法

氟离子可通过烷基化试剂进行衍生硅烷化，生成三甲基氟硅烷［62,63］，并通过有机溶液液液萃取，或过固相微萃取净化后，以气相色谱检测。黄薇等［64］将茶叶置于酸性水提取条件下的密闭体系中，茶叶中的氟与硅烷化试剂反应生成挥发性的三甲基氟硅烷，并以顶空气相色谱仪进行定量测定，方法的线性范围在2～200 mg·L-1，其最低氟含量检出限度为0.1 mg·L-1。然而，三甲基氟硅烷沸点低（16℉），在室温下不易保存和预处理，科研人员利用沸点更高（184℃）的二甲基苯基氯硅烷［65］与氟离子反应，衍生成高沸点的二甲基苯基氟硅烷，且衍生反应容易进行，便于GC-MS分析（具体衍生示意过程如图2所示）。后来发现，甲基氯硅烷水解产物HCL会严重损坏GC系统，又因衍生物中Si-F键在溶液中不稳定，特别是高pH的情况下影响其测定的准确性，KAGE等［66］利用五氟苄基溴在pH 6.8条件下对血液与尿中的氟离子进行烷基化，以生成碳氟稳定结构的五氟苄基氟化物，但是其报道的最低检测限只有0.5 mg·L-1。进一步，PAGLIANO E等［67］以四氯高铁酸三乙基氧铵对氟素衍生以生成氟乙烷，从而进行分析，该衍生剂虽然是强烈的乙基化试剂，但是其毒性大，易挥发，需要在通风橱中进行，并需要进行适当的保护，从而增加了实验难度。另外，对于生物样品中的氟化物，以2-(溴甲基)-萘［68］衍生后，以有机溶剂二氯甲烷萃取，然后用GC-MS测定，以2-氟萘并噻吩作为内标物，能够测定血浆和尿液中的氟化物；在确定的条件下，血浆或尿液的检测限分别为11 μg·L-1和7 μg·L-1，准确度在100.8%～107.6%范围内。

图2 氟离子烷基化衍生示意图Fig. 2 Schematic fluoride ion silylation

3.3 液相色谱法

基于氟素通过与金属元素络合物形成的三元体系在液相色谱柱中有一定的保留时间，从而实现其定量，如氟离子在锆或铪与2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基苯酚作用下形成三元络合物［69］，在585 nm检测波长下，线性范围为1～150 ng·mL-1；氟离子在硝酸镧及茜素三元体系中，加入三乙胺后，其络合物在液相色谱上的峰形也能得到明显改善［70,71］，如李华斌等［72］以镧离子茜素氨羧络合剂体系，甲醇水（18∶82，V/V）作流动相，获得了线性范围为0.01～1.0 mg·L-1，检出限为1 mg·L-1的茶叶中氟素定量的HPLC体系。另外，氟离子与三苯基羟基硅烷在高氯酸参与下衍生化反应生成含Si-F键［73］，且脂溶性较强产物后，也能够通过HPLC进行分析，洗脱时流动相所用有机溶剂的比例较大，其最低检测限为0.25 μM（即4.75 ppb）。

4 总结与展望

茶叶中的氟素近年来备受关注，主要是基于摄入含过高氟离子的茶叶可能会对人体身心产生不良影响。黑茶类产品由于以粗老茶叶生产，其氟含量往往较高，学者们为了解决茯砖茶中氟含量偏高的问题，对其进行了长时间的科技攻关，提出了一系列的降氟与控氟措施，如筛选培育低氟茶树品种，管控茶园土壤环境与茶园农药与化肥等投入品、茶鲜叶原料水捞法降氟及外源性降氟剂的使用，起到了较好的示范带动作用。

同时准确检测茶叶中的氟含量，将会助推黑茶类产品品质的提升与黑茶类降氟技术的开发。随着技术的进步，物质中氟离子的含量可通过电位法、光谱法、色谱法及流动注射、毛细管电泳、核磁共振法等［8,9］手段进行定量。氟化物测定方面的一个重大进步是1966年氟化镧单晶膜在离子选择电极应运开发，该方法目前已引用至茶叶中氟含量的测定（GB 19965-2005、GB/T 21728-2008、NY/T 838-2004），由于氟离子选择电极结构简单、测定快速的特性，使得其已在工厂和实验室得到广泛应用；然而，氟离子选择电极在检测过程中，易受到铝、铁等金属离子的干扰，以及电极电位的漂移也容易造成检测结果的偏差。另外电位法中的极谱法因汞易挥发，且毒性大，需要在通风环境良好的空间才能开展实验；原子光谱法需要特定的设备，从而一定程度上应用受到限制。

离子色谱法的灵敏度高，干扰少，出峰时间短，能够节省大量的试剂、简化检验流程，提高工作效率，但在离子色谱法测定茶叶样品过程中，良好的预处理是获得氟离子浓度精准测定的前提。另外，由于氟离子本身没有发色基团及氧化还原性，采用气相色谱法及高效液相色谱法等手段定量检测时需先对样品中的氟离子进行基团衍生化，鉴于气相色谱与液相色谱目前普及度较高，适宜的方法能够获得较为准确稳定的测定结果。同时，我们也应看到，比色法（如试纸比色、紫外可见分光光度法）因所需要设备简单，操作方便，较受广大实验人员的欢迎，如何开发出适应现代茶叶发展的快速准确的测定手段，是后续研究的重点方向。