活性炭脱色—比色法测定茶叶硝态氮

黄双杰，常亚丽，赵雅梅，曹梦珍，陈 义，郭桂义

（信阳农林学院茶学院/河南省豫南茶树资源综合开发重点实验室/河南省茶叶加工与检测工程技术研究中心，河南 信阳 464000）

茶作为世界三大非酒精饮料之一，因具有独特的滋味、香气、营养价值和保健功效而受到广大消费者的喜爱。据统计，世界饮茶人口已超过30亿，遍布160多个国家和地区［1］。近年来，随着人们生活水平的提高，食品安全越来越受到关注。茶树作为多年生叶用作物，具有喜氮和易于积累硝酸盐的特点［2,3］。因此，建立和完善茶叶中硝酸盐含量的检测方法具有重要的现实意义。

目前国内外已报道的硝酸盐测定方法有很多［3,4］，如分光光度法［5］、离子色谱法［6,7］、气相分子吸收光谱法［8］和电化学法［9］等。其中，分光光度法具有操作简单、经济、对实验设备要求低等特点，应用较为普遍。水杨酸比色法作为分光光度法的一种，常用于植物组织中硝酸盐氮含量的测定，其原理是在浓H2SO4条件下，NO3-与水杨酸反应生成硝基水杨酸，产物硝基水杨酸在碱性条件下（pH＞12）显黄色，于波长410 nm处有最大吸收峰，在一定范围内，其颜色深浅与含量成正比，可直接比色测定［10］。水杨酸比色法测定茶叶硝酸盐的研究早有报道［11,12］，但笔者在采用水杨酸比色法测定茶叶硝酸盐氮含量时发现，茶叶消煮后的滤液为黄褐色，加显色剂后并不呈现特征性颜色，可能由于茶叶中含有大量的多酚、色素和抗坏血酸等物质，干扰了显色效果。古小玲等在采用比色法测定茶叶亚硝酸盐时遇到同样的问题，通过加入碱式乙酸铅饱和溶液对茶汤进行脱色处理，将回收率提高到60%［13,14］。

活性炭是由木质、煤质和石油焦等含碳原料经热解、活化加工制备而成，是一种价格低廉、吸附性能良好的吸附剂，具有发达的孔隙结构、较大的比表面和良好的化学结构，能够吸附液体中的色素物质，具有脱色、脱臭的效果［15］。依据形状可将其分为粉末和颗粒两大类［16］，其中粉末活性炭常用于饲料［16］、酱腌菜［17］和调味酱［18］中的硝酸盐和亚硝酸盐测定，脱色效果良好，回收率在95%以上。那么它是否可用于茶叶硝酸盐氮含量测定，目前尚不清楚。本研究在水杨酸比色法的基础上，首先以脱色效果为考察指标，探索粉末活性炭1（Active carbon 1，AC1）和活性炭2（Active carbon 2，AC2）的脱色效果，确定最佳用量，在此基础上对系列浓度硝态氮标准溶液进行处理，研究最佳用量条件下两种活性炭对硝态氮回收率的影响，确定一种较好的脱色剂，使水杨酸比色法测定硝酸盐在茶叶上得以应用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

SpectraMax M2酶标仪（美国Molecular Devices公司）；H1850R台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；FW100高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器公司）；FA2104SN电子分析天平（1/10000，上海青浦）；SYG-1-1电热恒温水浴锅（上海本亭仪器有限公司）；Milli-Q Biocel纯水系统（法国JSAZ公司）；Costar 96孔酶标板（美国Corning公司）。

水杨酸、浓硫酸和氢氧化钠、硝酸钾（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；去离子水（18.25 MΩ cm）。

1.2 材料与处理

供试材料为七年生的福鼎大白茶［Camellia sinensis(L.) O. Kuntze. cv.Fuding dabaicha］的成熟叶（生物学顶端往下计算，第五片叶）和嫩梢，取自信阳市农业科学院科研基地。将茶树的成熟叶和嫩梢放于微波炉中，中高火杀青2 min，置于70～80℃的烘箱，烘至恒重，用万能粉碎机粉碎均匀，装入自封袋，放入-20℃冰箱，用于活性炭脱色试验。

AC1（分析纯，郑州申淘友仪器有限公司）：材质为木屑，粉状，细度为80目（占比15%）和200目（占比85%）混合，理论比表面积为450～900 m2·g-1；AC2（优级纯，郑州牛特牌农业技术有限公司）：材质为椰壳，粉状，细度为200目，理论比面积约1000 m2·g-1。

1.2.1 样品处理

称取3 g磨碎混匀后的茶粉，置于250 mL锥形瓶中，加入150 mL去离子水，用保鲜膜封口，置入沸水浴中提取30 min后取出，抽滤，将试样洗入250 mL容量瓶中，加水定容至刻度。

1.2.2 试剂配法

NO3--N标准溶液（100 mg·L-1）：精确称取0.7221 g烘干至恒重的硝酸钾溶于去离子水中，定容至1000 mL。

5%水杨酸-硫酸溶液：称取5 g水杨酸溶于100 mL浓硫酸（密度为1.84）中，搅拌溶解后，贮存于棕色瓶中，置冰箱保存1周有效。

8%氢氧化钠溶液：称取20 g氢氧化钠溶于250 mL去离子水中。

1.2.3 脱色活性炭用量探索

预实验过程中，在6 mL的茶样滤液中逐渐添加活性炭，AC1和AC2分别添加至6 g和0.6 g时，茶样滤液颜色初步消失。为进一步确定确定两种活性炭用量对茶样滤液干扰色素的脱色效果，取6 mL经1.2.1项下处理后的滤液9份，分别放入9支10 mL刻度带盖离心管中，分别标记为0、1、2、3、4、5、6、7和8号管，依次加入不同剂量的AC1或AC2（表1）。盖好盖后震荡摇匀3～5 min，8000 rpm离心20 min，用注射器吸取上清液2 mL，过0.45 μm孔径的水系滤膜于1.5 mL离心管中，观察滤液脱色效果。

表1 两种活性炭用量对茶液颜色去除效果Table 1 Effect of AC1 or AC2 in various dosages on color removal of tea extract

1.2.4 硝态氮系列浓度标准溶液配制

吸取100 mg·L-1NO3--N标准溶液0、2.5、5、10、15、20、30、40、50和60 mL分 别 放 入100mL的容量瓶，用去离子水定容至刻度，使之成0、2.5、5、10、15、20、30、40、50和60 mg·L-1NO3--N系列标准溶液。

1.2.5 最佳用量条件下两种活性炭对硝态氮测定结果和回收率的影响

预实验中，发现两种活性炭均具有茶样滤液脱色效果，但是否在吸附色素的同时带走硝态氮还不清楚。为进一步探索最佳用量条件下两种活性炭对硝酸盐测定结果和回收率的影响，设置3个处理组：对照组（CK）、活性炭1组（AC1）和活性炭2组（AC2）。CK：为1.2.4项下配制的NO3--N系列浓度标准溶液，不添加活性炭；AC1：在CK基础上加入1.2.3项下脱色所需要的AC1的量；AC2：在CK基础上加入1.2.3项下脱色所需要的AC2的量（表2）。

表2 标准工作液前处理Table 2 Pretreatment on standard solutions

吸取上述处理组样品液0.2 mL置于10 mL刻度带盖离心管中，加入5%的水杨酸-硫酸溶液0.4 mL，混匀后置室温下20 min，再加入9.4 mL 8%NaOH溶液，待冷却至室温后，以空白做参比，在酶标仪410 nm波长下测其吸光度。用CK标准曲线上的回归方程计算活性炭脱色后NO3--N浓度，并计算标准液脱色后的NO3--N回收率。

AC回收率（%）＝AC/CK×100%

2 结果与分析

2.1 两种活性炭加入量确定

为探索两种活性炭能否去除茶样滤液中的干扰色素，在6 mL的前处理液中逐渐添加活性炭，观察两种活性炭处理下滤液的颜色变化。由图1可知，随着活性炭用量的增加，茶样滤液颜色逐渐由深变浅直至消失，当AC1用量增加至6 g（1%，W/V），AC2用量为0.6 g（1‰，W/V）时，滤液颜色初步消失。故本试验确定6 mL备用滤液中加入AC1的量为6 g，AC2为0.6 g。以上结果表明AC1和AC2均能达到脱色效果，且AC2的脱色效果强于AC1。

图1 两种活性炭对茶叶滤液颜色去除效果Fig. 1 Effects of activated carbon treatments on color removal of tea extract

2.2 最佳用量条件下两种活性炭对硝态氮标准液测定结果和回收率的影响

为进一步探索1% AC1和1‰ AC2是否依赖硝态氮浓度对茶样滤液中硝态氮产生吸附效果，配制系列不同浓度的硝态氮标准工作液，进行活性炭脱色回收试验。与CK相比，AC1处理下的各浓度硝态氮标准液的颜色没有明显变化，而AC2处理后的颜色明显变淡（图2-A）。对410 nm波长下的吸光度进行测定，通过相关性分析计算回归方程，发现CK与AC1处理条件下的硝态氮浓度与吸光度显著相关，相关系数（R2）分别为0.9995和0.9998，而AC2处理后的硝态氮浓度与吸光度的相关性较低，R2为0.9396（图2-B）。

图2 活性炭处理对滤液硝态氮浓度的影响Fig. 2 Effects of activated carbon treatments on NO3--N concentration in filtrate

进一步将吸光度代入CK组直线回归方程计算硝态氮浓度，并统计回收率，与CK相比，AC1处理下的各硝态氮浓度变化较小，统计差异不显著，回收率在96.61%～115.04%；而AC2处理下的各硝态氮浓度显著下降，回收率受硝态氮浓度的影响，在硝态氮浓度为0～5 mg·L-1时，回收率为0%，而在10～60 mg·L-1范围时，回收率随硝态氮浓度的增加由2.24%增加到29.24%（表3）。

表3 活性炭处理对滤液中硝态氮回收率的影响Table 3 Effects of activated carbon treatments on recovery of NO3--N in filtrate

3 结论与讨论

植物体内硝态氮含量，不仅反映植物的氮素营养状况，而且对于鉴定食用植物及其加工制品的品质也有重要意义。水杨酸比色法常用于植物体内硝态氮含量的测定，但与其他植物不同，茶叶中含有大量茶多酚、色素等复杂化合物，对茶叶硝态氮的测定存在干扰，样品前处理一直是个难题。古小玲等［14］在测定茶叶亚硝酸盐时，采用碱式乙酸铅和硫酸溶液对茶汤进行脱色和参数优化，将回收率提高到72.90%～86.53%。本研究尝试利用活性炭良好的吸附性能，探索了两种粉末活性炭对茶叶前处理液的脱色效果和硝态氮回收率的影响。结果表明，两种活性炭均具备脱色效果，对于等量备用滤液，脱色所需AC1和AC2的量分别为1%和1‰（图1），与AC1相比，AC2的脱色效果较好，但对硝态氮的吸附也较强，造成回收率显著减少。AC2对回收率的影响依赖溶液中硝态氮的浓度，在硝态氮浓度为0～5 mg·L-1时，回收率为0%，而在10～60 mg·L-1范围时，回收率随硝态氮浓度的增加由2.24%增加到29.24%；而AC1对硝态氮的影响较小，回收率在96.61%～115.04%之间（表3）。因此本研究表明可采取1% AC1对茶样滤液进行脱色。

吸附是一个复杂的表面现象，影响活性炭吸附的因素有很多，如较大的比表面积、表面丰富的官能团和离子交换量等［19］比表面是影响活性炭物理吸附性能的主要因素之一，比表面积的大小决定了吸附质吸附位点的多少［20］。本研究所采用的AC2理论比表面积较大，可能是其吸附性能较高的原因之一。活性炭表面的官能团主要分为含氧官能团和含氮官能团，前者包括羧基、羧酸酐、内酯基、羟基和羰基等，特别是酸性官能团使活性炭表现出极性特征和阳离子交换特性；后者包含氨基、内酞胺基、类吡啶基和类酰胺基等，使活性炭表面表现出碱性特征以及阴离子交换特性［19－21］。有研究认为两种官能团能够分别为NH4+和NO3-提供阳离子和阴离子交换位点，在脱氮应用中发挥重要作用［21,22］。本研究中AC2表现出对NO3-的强烈吸附特性，推测其表面可能含有大量的含氮官能团。可能因为市面供应的活性炭性质参数有限，一些常规比色法尽管也提到添加活性炭去除色素，但并未对活性炭的规格、剂量和性质参数提出明确要求，因此在实际应用中，应根据测定目标选择适合的活性炭，以确保结果的准确性。