基于代谢组学分析光照对油茶鲜果后熟过程代谢物的影响

范兴，卢燕燕，吴建文

（1.广西职业技术学院，广西南宁530266；2.广西特色经济林培育与利用重点实验室，广西 南宁 530002；3.广西壮族自治区林业科学研究院，广西 南宁 530002）

油茶（Camellia oleifera Abel.）是我国重要的木本油料资源之一，油茶鲜果含有丰富的多酚类、黄酮类、多糖和茶皂素等物质，具有较好的经济价值[1]。油茶籽采收后有剥壳-摊晒、直接摊晒、堆沤-摊晒等处理方式，以提高含油率和油茶籽油的品质。葛永金等[1]发现，不同的后熟工艺对油茶籽油的品质影响很大。罗凡等[2]通过比较3种不同干燥方式，发现微波干燥处理能够有效提高油茶鲜果的出油率。刘晓晨等[3]发现光照萌发会增加亚麻籽油脂质伴随物的含量，进而提高亚麻籽油的营养品质。近年来，油茶籽油生产的发展方向逐步趋于标准化和自动化，要求在生产过程中实现数据实时监测，并据此形成信息化和智能化作业。因此，在油茶籽油加工过程中筛选特定的代谢产物，并将其作为判断工序进程的候选关键标志物，是今后实现油茶籽油连续化生产需要的理论基础。

代谢组学可定义为一种非选择性的综合分析复杂生物代谢网络的方法，用于鉴定和量化生物系统中的代谢物，通常适用于分子量低于1 500 Da的小分子[4]。近年来，基于液相色谱-电喷雾-串联质谱（liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry，LC-ESI-MS/MS）的广泛靶向代谢组学分析已越来越多地用于代谢物的分析和鉴定。目前，该分析方法已广泛用于模式植物和作物，如玉米、水稻、番茄和马铃薯等[5]。Guo等[6]通过LC-ESI-MS/MS获得了野生石榴的果皮和汁液中的次生代谢产物，发现石榴汁中黄酮类含量最高。Mctavish等[7]发现光照会改变果皮的新陈代谢，果皮通过产生黄酮醇糖苷等光保护化合物和改变脂质水平来对光照作出反应。酚类化合物是植物中重要的生物活性物质，主要是类黄酮。黄酮类化合物的含量和种类是植物颜色的主要决定因素。黄酮类化合物，包括花青素、儿茶素衍生物、黄酮类、黄烷酮类、黄酮醇类和异黄酮类，是构成植物次生代谢产物的重要组别。黄酮类化合物大量存在于有色水果、叶子和花朵中，它们发挥着许多关键功能，如色素沉着、调节种子休眠，以及对生物和非生物胁迫的保护[8]。

目前关于油茶鲜果在光照胁迫下代谢物的动态变化和生成途径尚不清楚，关于光照对油茶鲜果代谢物变化影响的报道也很少。因此本研究以广西地区油茶鲜果为试验材料，采用LC-ESI-MS/MS和多元统计的方法分析油茶鲜果后熟过程中小分子物质的代谢规律，识别差异代谢物，以期为油茶鲜果后熟加工工艺改良、油茶籽油品质提升和功能性成分富集等研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油茶鲜果由果皮和油茶籽组成，精选形态成熟、大小相近的“普通”油茶鲜果100 kg。

甲醇、乙腈、甲酸（均为色谱纯）：CNW科技（香港）有限公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相（ExionLC AD）、高灵敏度质谱（QTrap 6500+）：美国爱博才思公司；离心机（Heraeus Fresco17）：赛默飞世尔科技公司；纯水仪（明澈D24UV）：美国默克密理博公司；色谱柱（T3，1.8 μm×2.1 mm×100 mm）：美国沃特世公司；混匀仪（JCHY-100）：中国聚创公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备和代谢物提取

采后油茶鲜果分别置于黑暗条件下35℃、白光辐照下35℃恒温培养箱中进行后熟处理0、9、16 h。0 h设为对照组，光照组分别表示为LT_9、LT_16，无光照组分别表示为NLT_9、NLT_16。将不同后熟工艺处理后的油茶鲜果进行冷冻干燥处理后再进行研磨，称取50 mg的样品粉末至离心管中，加入提取液（甲醇与水体积比为 3 ∶1），涡旋 30 s，35 Hz研磨处理 4 min，冰水浴超声 15 min（40 kHz、10℃），在混匀仪上 4℃混匀处理12 h，样品在4℃条件下12 000 r/min离心15 min，取上清液，随后用0.22 μm微孔滤膜过滤上清液；用提取液稀释上清液5倍，涡旋30 s，每个样品各取50 μL混合成质控（quality control，QC）样品；-80℃备用。

1.3.2 高效液相色谱条件

液相色谱A相为0.1%甲酸水溶液、B相为乙腈。柱温箱温度为40℃、自动进样器温度为4℃、进样体积为 2 μL。

1.4 数据分析

所有质谱数据的采集及目标化合物定量分析工作均通过SCIEX Analyst Work Station Software（Version 1.6.3）来完成。

2 结果与分析

2.1 数据质量评估

所有QC样品总离子流（total ion chromatogram，TIC）图见图1。

图1 所有QC样品TIC图Fig.1 Total ion chromatogram（TIC）diagram of all quality control（QC）samples

由图1可知，QC样品TIC图的出峰保留时间和峰面积重叠良好，说明仪器稳定性好，测试结果可靠。

2.2 油茶鲜果代谢物的鉴定

为更好地解析光照对油茶鲜果后熟过程中的影响，采用LC-ESI-MS/MS对15个油茶鲜果样品进行代谢物分析，总共检测出739种代谢物。代谢物种类图见图2。

图2 代谢物种类Fig.2 Metabolite species

由图2可知，在正离子模式和负离子模式下鉴定的代谢物数量分别为711种和28种，其中主要有萜类118种、生物碱类97种、黄酮类88种、酚类53种、苯丙素类52种、类黄酮44种、氨基酸类38种、核苷酸类24种、木脂素22种、甾体类21种，糖类11种。

2.3 代谢物主成分分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）是一种无监督的多元数据分析方法，主要原理是采用投影法，以样品中检测到的化合物或光谱特征为维度，对多维空间中位置内的样本特征进行降维和表征。PCA常用于综合分析多维数据的聚类趋势[9]，也是最早用于代谢组学研究的方法之一[10]。

以5个样品组（正离子模式和负离子模式检测结果合并）的代谢物进行主成分分析，根据离散度分析样品重复性及差异性，判断仪器稳定性和数据有效性。若样品离散度小，则仪器稳定、检测结果可靠。全部样品的PCA得分散点图见图3。

图3 油茶鲜果后熟过程中代谢物主成分分析得分Fig.3 Principal component analysis score of metabolites in postripening process of Camellia oleifera fresh fruits

由图3可知，5个样品组明显分开，每个样品都能在同一个象限中，说明仪器具有较好的稳定性。样品组内生物学重复样品离散度小，表明生物学重复的重复性好，具有代表性，为后续代谢物分析结果的准确提供依据。另外，由图3可知，对照组在第一象限，与其它处理组距离较远，而光照组基本位于第二象限，与无光照组分离，由此可见，油茶鲜果不同后熟处理中光照对其代谢物有明显影响。

2.4 代谢物聚类分析

为进一步研究光照对油茶鲜果后熟的影响，并且能够更全面地展示代谢物表达模式的差异，通过距离矩阵计算所有样品和代谢物的表达水平。然后将层次聚类用于聚类分析并生成热图，从而显示油茶鲜果样品中代谢物在不同处理下的变化。不同后熟条件下油茶鲜果代谢物的聚类热图见图4。

图4 不同后熟条件下油茶鲜果代谢物的聚类热图Fig.4 Cluster heatmap of metabolites of Camellia oleifera fresh fruits under different post-ripening conditions

红色方块表示该样品中代谢物的含量高于样品的平均值，绿色方块表示该样品中该代谢物的含量低于该样品的平均值，颜色越深表示代谢物差异越大。由图4可知，代谢物一共分为10簇，不同的生物学重复之间也同样聚成了1簇，表明生物学重复之间具有良好同质性和数据的高可靠性。LT_9单独形成1簇，LT_16与NLT_16形成1簇，说明光照处理对油茶果代谢物产生明显影响，随着后熟时间的推移，影响越来越小。因此，从聚类分析和主成分分析都可以表明油茶鲜果在不同的后熟处理中代谢物产生了明显的差异。

2.5 代谢物差异性比较

正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）是一种具有监督模式识别的多元统计分析方法，可以最大限度地提高群体分化并帮助发现差异代谢物。如张林祥等[11]的研究表明通过空固相微萃取气质联用仪（headspace solidphase microextraction gas chromatograph，HS-SPME-GCMS）结合OPLS-DA可对多个产地玫瑰醋的风味进行有效区分。黄晓欣等[12]的研究表明利用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱法代谢组学结合OPLS-DA可以对不同产地酸枣仁化学成分进行标志物快速筛查。通过OPLS-DA模型进行样本两两比较，得分图如图5所示。

图5 差异代谢物的OPLS-DA成对比较的得分图Fig.5 Score plots of pairwise comparisons of differential metabolites by OPLS-DA

由图5可知，所有样本两两差异明显。

两个样品组之间代谢物表达水平的差异可以通过火山图来观察，差异代谢物以差异倍数≥2和差异倍数≤0.5以及VIP≥1的作为筛选标准[13]。显著差异代谢物统计表见表1。

表1 显著差异代谢物统计Table 1 Significant differential metabolites

差异代谢物火山图见图6。

图6 差异代谢物火山图（VIP≥1，FC≥2或≤0.5）Fig.6 Volcano map of differential metabolites（VIP≥1，FC ≥ 2 or≤0.5）

如表1和图6所示，对照组与LT_9、对照组与LT_16、对照组与 NLT_9、对照组与 NLT_16、LT_9 与 LT_16、LT_9 与 NLT_9、LT_16 与 NLT_16、NLT_9与NLT_16差异表达显著的代谢物总数分别为159、164、173、176、144、173、121个和183个。NLT_9与NLT_16比较组中差异表达明显的代谢物总数最多。

为了清楚的展示有光和无光处理的差异，进一步探讨LT_16与NLT_16中差异成分的变化，对变化前20（上调和下调）的差异品质成分进行倍数比较分析，LT_16与NLT_16的差异成分倍数分析图见图7。

图7 LT_16与NLT_16的差异成分倍数分析图Fig.7 Plot of differential component ploidy analysis of LT_16 vs NLT_16

如图7所示，上调和下调前10的物质主要为萜类、黄酮、生物碱和酚类。光是植物生长发育最重要的环境因子之一，直接参与植物最重要的生理进程——光合作用。项目组前期研究发现，光照胁迫能够激发光敏色素信号通路，调控脱落酸（abscisic acid，ABA）的代谢，图7中3-甲基黄嘌呤的上调也可能与光照激发有关，作为植物激素促进细胞的分裂。ABA合成的前体物质法呢基焦磷酸（farnesyldiphosphate，FPP），也是角鲨烯合成前体物质，光照处理激发了ABA的合成，从而提升了角鲨烯含量，其与甾醇含量呈现“此消彼长”趋势，而图7中氢化可的松呈现的下调趋势与“此消彼长”的现象相吻合。光照对不同植物的萜类含量积累具有较大影响，植物在最优的光照下生长，萜类的物质积累最丰富[14-15]。黄酮类物质是一类以光合产物为基础的次生代谢产物，光照对黄酮类物质的合成产生影响，一般来说光照会增加黄酮类物质的积累[16-17]。有研究表明，光照的强度与生物碱的积累成反比关系[18-19]。蓝光连续照射显著提高大豆芽苗中黄酮类化合物的含量[20]。常建伟等[21]发现不同光质对植物的多酚类也有显著性影响。因此，光照对油茶鲜果在后熟过程中的次生代谢产物积累有明显影响。

2.6 差异次生代谢产物功能注释和富集分析

使用KEGG数据库对LT_16与NLT_16之间的121种差异次生代谢产物进行注释。差异代谢物的KEGG通路富集图见图8。

图8 差异代谢物的KEGG通路富集图（LT_16与NLT_16）Fig.8 KEGG pathway enrichment map of differential metabolites（LT_16 vs NLT_16）

由图8可知，每一个圆点表示一个KEGG通路，纵坐标为通路名称，横坐标为富集因子，表示LT_16与NLT_16之间差异的代谢物中注释到该通路的比例与油茶果中代谢物注释到该通路比例的比值，富集因子越大，表示差异代谢物在该通路的富集显著性越可靠。LT_16与NLT_16主要参与了类黄酮、黄酮和黄酮醇的生物合成，主要体现在代谢通路中。LT_16与NLT_16的差异是由光照引起的，这与程佳丽等[22]发现的结果一致，光照可以调节苦荞芽中苯丙氨酸解氨酶、黄酮醇合酶、查耳酮合成酶及查耳酮异构酶的表达水平，这些酶与黄酮类物质的合成有很大的关系，通过提高酶的表达水平来提升黄酮类物质的富集。

3 讨论与结论

本研究采用基于液相色谱-电喷雾-串联质谱平台的广泛靶向代谢组学技术，对不同后熟处理条件下（有光和无光）油茶果的代谢物进行分析，总共检测出739种代谢物，55个代谢物种类，主要有萜类118种、生物碱类97种、黄酮类88种、酚类53种、苯丙素类52种、类黄酮44种等。多元统计分析表明，光照对油茶鲜果后熟过程代谢物影响显著，差异代谢物中上调和下调前10的物质主要为萜类、黄酮、生物碱和酚类。将差异代谢物总数最多的比较组进行KEGG数据库匹配，对注释完的结果进行富集分析，发现差异代谢物主要注释和富集在类黄酮、黄酮和黄酮醇的生物合成通路。油茶籽油脂溶性成分如角鲨烯、甾醇等是评价油脂品质的重要指标，角鲨烯属于三萜类物质，同时也是甾醇代谢的上游物质，光照对油茶果后熟过程萜类物质代谢影响明显，但其对角鲨烯、甾醇合成的影响尚不清楚，是否能够迁移到油茶籽油中还需进一步确认。