3种干腌火腿中细菌群落结构和风味的差异及相关性分析

徐荟，邓洁莹，2，李小敏，吴莹，李沛军，2，徐宝才，2*

（1.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽 合肥 230009；2.合肥工业大学肉类微生物控制与利用轻工业重点实验室，安徽 合肥 230009）

干腌火腿是发酵肉制品中具有代表意义的一类产品，是以猪后腿为原料，经过腌制、晾晒和长时间地发酵、后熟而制成的。除了被称为中国三大火腿的金华、宣威和如皋火腿，意大利的Parma和Speck Alto Adige火腿、西班牙的Iberian和Serrano火腿、法国的Bayonne火腿等都是世界上广受好评的火腿产品[1]。由于原料、加工工艺和地理环境等条件的不同，不同地区火腿的风味、质地和色泽均有明显差异[2]。

微生物和内源酶是决定火腿品质和风味的重要因素[3-4]，在发酵过程中使原料肉发生一系列物理及生化反应，进而形成特殊的风味并能够长期保存[5]。不同产地的火腿由于采用的原料、加工工艺和环境等条件不同，其发酵过程中的微生物群落结构也不同，这对其风味和营养价值有直接的影响[6]。

随着组学技术的发展，高通量测序技术被广泛用于发酵食品的微生物多样性研究中[7-9]。Lin等[10]结合宏基因组和代谢组学分析，阐明不同成熟阶段的老挝火腿的微生物群和代谢谱，并对优势微生物与代谢物进行相关性分析。Wang等[4]探究发酵过程中金华火腿的优势菌群与主要挥发性化合物的关系，发现葡萄球菌与醛类物质的生成有关。Zhu等[5]基于高通量测序和代谢组学证实了微生物和代谢物之间存在正相关关系，微生物发酵可以促进火腿的口感和风味。研究表明，火腿发酵过程中的微生物多样性对其风味和品质有重要影响[11]。然而，关于比较不同火腿产品中微生物的差异及其与风味差异的相关性研究鲜见报道。本文采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（headspacesolid phase microextraction-gas chromatograph-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）测定金华、如皋和宣威3种传统干腌火腿的挥发性风味物质，同时利用高通量测序技术研究3种火腿微生物的群落结构，将优势菌群信息与风味物质信息关联，探讨微生物对风味产生的影响，为分析微生物与火腿风味之间的关系提供参考，对火腿生产过程中稳定和改善火腿品质具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金华火腿、如皋火腿、宣威火腿：市售。每组火腿取平行样品3份。金华火腿、如皋火腿、宣威火腿分别标记为JH、RG、XW，置于冻存管中-80℃冰箱保存用于高通量测序试验，剩余样品储存于-20℃冰箱进行后续风味物质分析。

环己酮标准品（分析纯）：美国Sigma公司；17种氨基酸（天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸）标准品：德国Sykam公司；其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

全自动氨基酸分析仪（S-433D）：德国Sykam公司；气质联用仪（CMS-QP2010）：日本岛津公司；固相微萃取针（50/30DVB/CAR/PDMS）、固相微萃取手柄（57330U）：美国Supelco公司。

1.3 游离氨基酸的测定

取适量火腿样品于121℃下烘干油脂和水分后，称取0.1 g，加入4 mL 4%磺基水杨酸溶液，超声辅助提取30 min[12]。浸提结束后静置10 min，取1.5 mL上清液于 2 mL 离心管中，离心 30 min（8 000×g、4 ℃）；移取1 mL上清液过0.22 μm水相滤膜，所得溶液采用全自动氨基酸分析仪检测，同时检测17个游离氨基酸的标准混合溶液。引用味觉活性值（taste activity value，TAV）来评价物质的味觉活性强度[13]。

1.4 挥发性风味物质的测定

采用固相顶空微萃取法萃取风味化合物，气相色谱串联质谱法测定[14]。取火腿肉样切碎，称取（4.0±0.2）g样品，加入环己酮标准品，于55℃下加热吸附40 min。

色谱条件：色谱柱为DB-5MS毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），柱箱初始温度 40 ℃持续 3 min，然后以5℃/min升温至180℃，再以10℃/min升温至240℃并持续3 min。载气为氦气，纯度≥99.999%，流速为1.0 mL/min，选择不分流模式。质谱条件：离子源温度230℃、接口温度250℃、扫描质量范围m/z 30～500。

将获得的GC-MS图谱与NIST和WILEY数据库对比检索，选择结果中相似度≥80%的化合物。采用面积归一化法[15]计算每种物质的相对含量，进行定量分析。引用气味活度值（odor activity value，OAV）来判定所测定的金华火腿风味物质中的主要活性物质。

1.5 高通量测序

火腿样品中微生物DNA的提取、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增、纯化和测序方法按照试剂公司提供的试验操作指南进行。

1.6 数据处理

本试验中数据处理主要使用Excel及SPSS进行统计分析，以平均值±标准差表示。两组数据间比较采用t检验法，以P＜0.05表示差异显著。相关性分析利用spearman系数进行分析，使用Origin及Graphpad prism 8作图。

2 结果与分析

2.1 不同干腌火腿中游离氨基酸含量及TAV值

游离氨基酸是反映干腌火腿滋味的重要指标，其测定结果与TAV值见表1。

表1 干腌火腿中游离氨基酸含量及TAV值Table 1 Content of free amino acids and TAV value in dry-cured hams

由表1可知，在金华、如皋和宣威3种干腌火腿中共检测出17种游离氨基酸。金华火腿中总游离氨基酸含量最高，达到4 355.02 mg/100 g；宣威火腿中总游离氨基酸含量最低，为3 930.62 mg/100 g。3种火腿中，TAV值大于1的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸等；如皋火腿中TAV值最大的是谷氨酸，金华火腿和宣威火腿中TAV值最大的是赖氨酸。谷氨酸是食品中常见的鲜味物质，赖氨酸对火腿的特殊滋味具有重要作用[16]。

游离氨基酸是影响火腿风味的重要物质，按照呈味特性可分类为鲜味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸和无味氨基酸[17]。丙氨酸是3种火腿中的主要甜味氨基酸，金华和如皋火腿中丙氨酸含量均显著高于宣威火腿（P＜0.05），分别为 406.21mg/100 g和 421.65 mg/100 g。丙氨酸在甜味氨基酸中阈值最低，且后期可以转化为醛类化合物促进火腿的风味[18]，对火腿的滋味具有重要作用。天冬氨酸和谷氨酸是鲜味物质，3种火腿中谷氨酸含量均高于天冬氨酸，且其阈值更低、TAV值更高，说明谷氨酸是主要的呈鲜物质。如皋火腿和金华火腿中谷氨酸含量较高，分别为549.28 mg/100 g和507.98mg/100g，宣威火腿中鲜味氨基酸的总含量显著低于金华火腿和如皋火腿（P＜0.05），为 646.64 mg/100 g。

总体上，金华火腿和如皋火腿的氨基酸组成结构相似，与宣威火腿相比，其主要呈味氨基酸中鲜味和甜味氨基酸较为突出。肉制品的发酵及成熟过程中，蛋白质在微生物酶和内源酶的作用下分解产生游离氨基酸[19]，而不同种类的火腿中微生物群落结构的差异会使氨基酸含量不同，最终导致滋味和风味的不同。

2.2 不同干腌火腿中的挥发性风味物质

金华、如皋、宣威火腿中的挥发性风味物质含量及OAV值见表2。

表2 干腌火腿中挥发性风味物质含量及OAV值Table 2 Content of volatile flavor substances and OAV value in dry-cured hams

续表2 干腌火腿中挥发性风味物质含量及OAV值Continue table 2 Content of volatile flavor substances and OAV value in dry-cured hams

由表2可知，在金华、如皋、宣威3种干腌火腿中共检测出醛类、酸类、醇类、酯类、酮类、烃类和其它共7类、72种挥发性风味物质。金华火腿中的挥发性风味物质的总含量最高，达到1 173.56 μg/100 g，如皋火腿和宣威火腿中挥发性风味物质含量较低，分别为959.26 μg/100 g和 808.99 μg/100 g。3 种火腿中醛类化合物在所有挥发性风味物质中所占比例最大，这一结果与Huan等[20]的研究一致。本研究中金华火腿的酯类、烃类化合物的含量显著高于如皋和宣威火腿（P＜0.05）。

己醛和壬醛是3种干腌火腿中含量较高的醛类化合物，其含量远高于其它醛类化合物。宣威火腿中的己醛含量显著高于金华和如皋火腿（P＜0.05），己醛通常被认为是干腌肉制品中的主要氧化产物，可能会产生蔬菜和水果味。金华火腿中壬醛含量最高为173.28 μg/100 g，其次是如皋火腿中 166.29 μg/100 g，宣威火腿中壬醛含量最低为150.09 μg/100 g，壬醛具有甜味和果味[21]。苯甲醛有一种宜人的杏仁味，是由Strecker反应产生的[22]，只在金华和如皋火腿中被检测出。

壬醛的OAV值大于10，是干腌火腿的主要挥发性风味物质。本文中检测到的醛类化合物也是国内外其它火腿中常见的风味物质[23]。由于醛类化合物的含量高且阈值较低，一般被认为对干腌火腿风味具有重要贡献[24]。

金华火腿中酸类化合物的总含量高于如皋和宣威火腿中酸类化合物的含量。酸类化合物是金华火腿的重要标志，可能是由微生物发酵产生[25]，但其较高的阈值对火腿的风味贡献值不大。金华火腿中检测到的醇类化合物种类和含量较少，宣威火腿的中1-辛烯-3-醇是其主要醇类化合物，也是肉制品中常见的醇类化合物质，但在另外两种火腿中未检测到，其OAV值大于1，对宣威火腿的风味有重要作用。茴香脑一般来源于植物香料中，如皋火腿中茴香脑含量较高，而金华火腿中未检测到，可能是不同火腿腌制过程中添加的配料不同导致的。

2.3 不同干腌火腿微生物群落组成

对3种干腌火腿微生物的高通量测序结果见图1。

图1 不同干腌火腿微生物群落组成Fig.1 Microbial community composition of different dry-cured hams

由图1可知，3种火腿注释到细菌门水平上主要有厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteriota）。其中厚壁菌门占据主要地位，金华火腿中的厚壁菌门所占比例要大于如皋火腿和宣威火腿，相对丰度达到87%。与葛庆丰[26]的研究一致，厚壁菌门是所有火腿中绝对优势的细菌门。如皋火腿中放线菌门相对丰度明显高于金华火腿和宣威火腿。

在细菌属水平上，金华火腿中的优势菌属为葡萄球菌属（Staphylococcus）、四联球菌属（Tetragenococcus）和嗜冷杆菌属（Psychrobacter）。如皋火腿中的优势菌属为葡萄球菌属、四联球菌属和科贝特氏菌属（Cobetia）。宣威火腿中的优势菌属为葡萄球菌属、盐单胞菌属（Halomonas）和科贝特氏菌属。葡萄球菌属在3种干腌火腿的微生物群落中均占据主要地位，与Wang等[4]的研究一致。葡萄球菌属在金华火腿中的相对丰度为63.77%，明显高于如皋火腿和宣威火腿。四联球菌属和盐单胞菌属等均属于耐盐性细菌，可以在盐含量较高的火腿产品中生存，是成品中较为优势的细菌属。

3种干腌火腿中的葡萄球菌属在各自微生物群落结构中相对丰度均最大，金华火腿中葡萄球菌属、四联球菌属相对丰度明显高于如皋、宣威火腿，而如皋火腿中的科贝特氏菌属和宣威火腿中的盐单胞菌属要高于金华火腿。有研究表明，宣恩火腿表面细菌主要为葡萄球菌属、沙雷氏菌属等[27]，盘县火腿中的优势细菌属为葡萄球菌属和盐单胞菌属[28]。葛庆丰[26]对不同金华火腿成熟车间的微生物多样性的研究发现，车间微生物群落结构的差异会导致火腿肉样中微生物的不同。因此，火腿菌落结构的差异可能由原料、制作工艺、产地、工厂环境等因素的不同导致，而不同的微生物组成可能使发酵产品的风味不同。

2.4 主要呈味氨基酸与优势菌属的相关性分析

在比较不同干腌火腿氨基酸和微生物群落差异的基础上，利用相关性分析火腿主要细菌属与TAV＞1的呈味氨基酸可能的相关作用，通过相关性热图表示。干腌火腿主要氨基酸与优势菌属相关性热图见图2。

图2 干腌火腿主要氨基酸与优势菌属相关性热图Fig.2 Heat map of correlation between main amino acids and dominant bacterial genera in dry-cured hams

由图2可知，火腿中的葡萄球菌属与谷氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸和丙氨酸均呈显著正相关（P＜0.05）。金华火腿和如皋火腿中的葡萄球菌属比例较高，同时谷氨酸、缬氨酸等鲜味苦味氨基酸含量较高，表明干腌火腿中TAV＞1的主要呈味氨基酸的变化与优势菌属存在一定的相关作用。

盐单胞菌属与火腿中天冬氨酸和苏氨酸的含量呈极显著正相关（P＜0.01），而宣威火腿中盐单胞菌属的比例、天冬氨酸和苏氨酸的含量要高于如皋火腿和金华火腿，可能是盐单胞菌属的存在促进了宣威火腿中蛋白质水解生成天冬氨酸和苏氨酸。嗜冷杆菌属、假单孢菌属与缬氨酸和蛋氨酸等部分苦味氨基酸呈正相关，且有利于甘氨酸和丝氨酸等甜味氨基酸的产生。干腌火腿中的微生物与游离氨基酸的产生具有一定的相关性，可能是由于蛋白质在内源酶的作用下被分解成小分子肽，被微生物酶进一步水解成游离氨基酸，从而影响游离氨基酸的组成和含量及火腿的滋味[29]。

2.5 关键挥发性风味物质与优势菌属的相关性分析

将干腌火腿中OAV值＞1的挥发性风味物质与主要细菌属进行Spearman关联分析，并通过相关性热图表示，结果见图3。

图3 干腌火腿中关键挥发性风味物质与优势细菌属的相关性热图Fig.3 Heat map of correlation between key volatile flavor substances and dominant bacterial genera in dry-cured hams

由图3可知，葡萄球菌属、四联球菌属、盐单胞菌属、嗜冷杆菌属与火腿中的主要醛类物质有一定的正相关性。葡萄球菌属与四联球菌属有利于苯甲醛、壬醛、3-辛醇和3-甲硫基丙醛的产生。葡萄球菌属在其它类型的火腿制品中也占主导地位[30]，如中国盘县火腿[31]和西班牙伊比利亚火腿[32]，因此葡萄球菌属可能是干腌火腿风味产生的重要贡献者。苯甲醛含量变化与葡萄球菌属呈极显著正相关（P＜0.01），苯甲醛可能是由葡萄球菌属的氨基酸代谢产生的[33]。已有研究表明四联球菌属在发酵食品中可以提高食品中有机酸、醛类和酯类等风味物质含量[34]，因此，在本试验中四联球菌属与庚醛、苯甲醛等物质有显著正相关性，具有一定的产香能力。盐单胞菌属与己醛、（E）-2-壬烯醛、（Z）-2-庚烯醛等主要风味物质的产生呈显著正相关（P＜0.05）。与其它研究相似，葡萄球菌属和盐单胞菌属可能是火腿风味的潜在贡献者[28]。由此可知，传统发酵火腿独特风味的形成与微生物的生长代谢密切相关[29]，微生物发酵促进了肉类蛋白质和脂质的水解，这可能有助于风味和感官质量的发展[35]。

3 结论

本文通过高通量测序的方法比较了不同种类干腌火腿的微生物群落结构的差异，并将菌群结构差异与游离氨基酸和挥发性风味变化进行相关性分析，探究可能影响火腿滋味与风味的因素。金华和如皋火腿中呈鲜味的谷氨酸和呈甜味的丙氨酸显著高于宣威火腿，宣威火腿中的天冬氨酸显著高于金华、如皋火腿。己醛和壬醛都是火腿中关键风味物质，宣威火腿中己醛含量最高，而金华火腿中壬醛含量最高。从微生物群落结构来看，金华火腿中的葡萄球菌属、四联球菌属比例较高，而宣威火腿中盐单胞菌属的含量高于另两种火腿。相关性分析表明火腿中的葡萄球菌属与谷氨酸、蛋氨酸等氨基酸的含量呈显著正相关，同时对壬醛和苯甲醛等风味物质的产生也有着重要的促进作用；盐单胞菌属与己醛、（E）-2-壬烯醛等主要风味物质的产生呈显著正相关。说明主要微生物属对火腿的滋味和风味的形成有重要的相关作用。对火腿中的微生物菌群和优势菌种的研究有利于制备优良的肉品发酵剂以缩短发酵过程的时间、提高干腌发酵火腿的品质。