非洲紫罗兰组织培养及抗褐化探究

陈小强， 李 红， 邹明伟， 郭瑞超， 王宏鹏， 次尔甲玛， 谢晓东(天津农学院农学与资源环境学院， 天津 300384)

非洲紫罗兰(Saintpauliaionantha)是苦苣苔科非洲紫苣苔属的多年生草本植物，又名非洲堇。非洲紫罗兰的花和叶均具有独特的观赏价值，是良好的装饰花卉[1]，常规繁殖方法多采用播种法和叶插法，但用这些方法生产的商品苗繁殖系数低，品质较差，不能满足新品种推广的需求[2]。因此，需要为非洲紫罗兰寻求一种高效稳定的繁殖育种方法。植物组织培养可以实现非洲紫罗兰的快速繁殖，能在较短的时间内获得大量成品苗，其后代能稳定保持母株的优良性状，为工厂化育苗奠定基础。

近年来，关于非洲紫罗兰组织培养技术的研究逐渐增多，但国内对非洲紫罗兰抗褐化方面的研究依旧较少[3]。使用抗褐化剂能抑制多酚氧化酶反应并减少负责抗氧化活性的酚类物质损失[4]，优化培养环境。有研究表明抗坏血酸的自氧化特性可有效防止多酚化合物的氧化[5]。因此，使用抗褐化剂可以有效防止试管苗褐变，优化培养条件，前景十分可观。

本试验采用L9(34)正交试验设计，探究不同碳源、植物激素和抗褐化剂对非洲紫罗兰试管苗组织培养的影响，优化非洲紫罗兰增殖和生根的培养条件，可为工厂化育苗奠定理论基础，对非洲紫罗兰的良种快繁有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以天津农学院植物细胞工程研究中心生长良好的非洲紫罗兰试管苗作为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1非洲紫罗兰试管苗的增殖培养

增殖试验采用L9(34)正交设计，试验因素为不同种类的碳源、抗褐化剂和不同植物激素配比，各因素随机排列(表1)，空白处理为MS培养基+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L。

表1 非洲紫罗兰试管苗增殖正交设计Table 1 Orthogonal design of proliferation of Saintpaulia ionantha seedlings in vitro

1.2.2非洲紫罗兰试管苗的生根培养

生根试验采用L9(34)正交设计，试验因素为蔗糖浓度、抗褐化剂和不同种类的生长素，试验采取完全随机设计(表2)，空白处理为1/2 MS培养基+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L。

表2 非洲紫罗兰试管苗生根正交设计Table 2 Orthogonal design of rooting experiment for Saintpaulia ionantha seedlings in vitro

1.2.3培养条件

接种后将试管苗置于天津农学院植物组织培养室，培养条件：温度(25±2)℃，光照2 000 lx，光照时间16 h/d。

1.3 测定指标

褐化率(%)=(褐化叶芽数/试管苗总叶芽数)×100%；

增殖系数=增殖后总叶芽数/接种叶芽数；

生根率(%)=(生根的试管苗数/试管苗总株数)×100%；

平均生根数(条/株)=∑试管苗的生根数/试管苗总株数；

平均根长(cm)=∑试管苗的根长/试管苗的生根数；

褐化评价：∑单瓶褐化评价分数/5；

褐化评价标准：无褐化0，轻微褐化0～1，中度褐化1～2，严重褐化2～3。

1.4 统计分析

采用Excel 2016软件进行试验数据的整理记录，使用IBM SPSS Statistics 25软件进行试验数据的方差分析，Minitab 17软件进行试验数据的直观分析。

2 结果与分析

2.1 非洲紫罗兰试管苗增殖研究

非洲紫罗兰试管苗增殖正交试验结果(表3)表明，3种试验因素对非洲紫罗兰试管苗增殖系数的影响表现为植物激素>碳源>抗褐化剂，对试管苗褐化率的影响表现为抗氧化剂>植物激素>碳源，这说明植物激素为影响试管苗增殖系数的主要因素，且抗褐化剂对试管苗增殖系数影响最小，对褐化的表现影响最大。极差分析结果可知，本试验中非洲紫罗兰试管苗增殖最优处理为MS+蔗糖20 mg/L+抗坏血酸100 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L。以增殖系数X和褐化率Y作为因变量进行方差分析(表4)。结果表明不同植物激素对非洲紫罗兰试管苗增殖的影响达到了显著水平(p<0.05)。

表3 非洲紫罗兰试管苗增殖培养正交试验结果及极差分析Table 3 Orthogonal test results and range analysis of proliferation of Saintpaulia ionantha seedlings in vitro

表4 非洲紫罗兰试管苗增殖培养正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test result for proliferation of Saintpaulia ionantha seedlings in vitro

2.2 非洲紫罗兰试管苗生根研究

由表5的试验结果可知，试验因素对3种生根指标(生根率、平均生根数和平均根长)有不同程度的影响，其中植物激素对非洲紫罗兰试管苗的生根效果影响最大。抗褐化剂对非洲紫罗兰试管苗生根效率的影响非常小，但对抗褐化效果的影响较大。结合极差分析，综合考虑3种生根指标，非洲紫罗兰试管苗生根最优处理为蔗糖20 g/L+柠檬酸100 mg/L+IBA 0.2 mg/L。

表5 非洲紫罗兰试管苗生根正交试验结果及极差分析Table 5 Orthogonal test results and range analysis of rooting of Saintpaulia ionantha seedlings in vitro

褐化控制方面，试验结果表明，抗褐化剂对非洲紫罗兰试管苗生根效率的影响非常小，使用柠檬酸和PVP的抗褐化效果要优于AC，且试验因素对抗褐化效果的影响表现为抗褐化剂>植物激素>蔗糖浓度，这说明选用合适的抗褐化剂能明显改善非洲紫罗兰试管苗的生根条件。结合极差分析，非洲紫罗兰试管苗生根最优处理为蔗糖20 g/L+柠檬酸100 mg/L+IBA 0.2 mg/L，生根率为100%，平均生根率为4.1%，平均根长为0.31cm，褐化评价为0。理论最优处理实际效果差于处理6。综上，非洲紫罗兰最优培养基为处理6(蔗糖20 g/L+柠檬酸100 mg/L+NAA 0.2 mg/L)。

方差分析结果(表6)表明，蔗糖浓度对平均根长的影响存在显著差异(p<0.05)，植物激素对生根率和平均生根数的影响存在显著差异(p<0.05)。

表6 非洲紫罗兰试管苗生根正交试验因变量P, N, L, E方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal test dependent variables P, N, L, E for rooting of Saintpaulia ionantha seedlings in vitro

3 讨论与结论

3.1 非洲紫罗兰试管苗增殖研究

耿明清[6]的研究中，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L为非洲紫罗兰增殖的最优培养基，且表明过量或不足的激素添加比例均会劣化非洲紫罗兰的增殖

效果。本试验中，不同比值的植物激素配方对非洲紫罗兰试管苗增殖有显著影响。试验结果表明，非洲紫罗兰试管苗在有6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L的3个处理中增殖系数均超过2.28，增殖芽最多。

同用抗坏血酸作为抗褐化剂的处理5和处理8虽然褐化率较低，但试管苗长势较差。究其原理，抗坏血酸是一种酚氧化酶抑制物，它可以将该酶的二价铜离子还原成一价铜离子[7]。上述现象可能是由于抗坏血酸与培养基中的酚类物质作用后的反应产物抑制了试管苗增殖，或是该试验中抗坏血酸剂量过大对非洲紫罗兰试管苗产生了毒害作用[8]。与抗坏血酸相比，使用半胱氨酸和柠檬酸作为抗褐化剂的处理组褐化率普遍偏低，且处理1和处理8并不存在褐化现象。结合极差分析和方差分析，将施加相同剂量的半胱氨酸和柠檬酸的处理结果做对比，施加柠檬酸的抗褐化表现更好，因此本试验选取柠檬酸为非洲紫罗兰试管苗增殖诱导最优抗褐化剂。

碳源对增殖系数和褐化率的影响较小，其中使用蔗糖20 g/L作为碳源的处理8和处理9增殖系数均超过了2.27，且褐化程度较低，故选取蔗糖为最优碳源。

综上，本试验中非洲紫罗兰试管苗增殖诱导最优处理为MS+蔗糖20 mg/L+抗坏血酸100 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L。

3.2 非洲紫罗兰试管苗生根研究

耿明清等[6]的实验结果表明，1/2 MS+IBA 0.2 mg/L为最优生根培养方案。而杨晨星[9]和吕德任[10]的研究发现，非洲紫罗兰最佳生根激素均为0.2 mg/L NAA。这说明，同浓度下(0.2 mg/L)的NAA和IBA均有作为非洲紫罗兰生根诱导最优生长激素的潜力。

本试验发现，非洲紫罗兰试管苗容易生根，试验中生根率水平普遍高于50%。试验中选取了生根率、平均生根数和平均根长作为研究指标，以便更全面地了解3种试验因素对非洲紫罗兰试管苗生根的影响。生根率方面，使用IBA 0.2 mg/L的3个处理中有两个处理达到了全部生根，说明同浓度下，IBA最易诱发非洲紫罗兰试管苗生根。

碳源的种类和用量不仅影响试管苗的生根效率，而且对其地上部形态建成有十分重要的作用，是影响非洲紫罗兰培养成功与否的关键因素之一[11]。有资料表明，碳源浓度最佳值通常在2%～5%，生根的时候碳源浓度适当降低有利于试管苗根系的生长[12]。试验中平均生根数达到最优水平为蔗糖20 g/L+柠檬酸100 mg/L+NAA 0.2 mg/L，且选取生长激素为NAA 0.2 mg/L的处理平均根长水平也是最优，蔗糖20 g/L作为碳源的处理中平均生根数总和最多。褐化情况方面，选用柠檬酸100 mg/L，PVP 100 mg/L作为抗褐化剂的处理中均无褐化现象产生，而且极差分析结果表明，使用柠檬酸的抗褐化效果稍优于PVP。

综上，非洲紫罗兰试管苗生根最优处理为1/2 MS+蔗糖20 g/L+柠檬酸100 mg/L+NAA 0.2 mg/L。