枯草芽孢杆菌菌剂对不同品种长柄扁桃抗旱酶系和光合特性的影响

王玉宝， 姜文婷， 高翔菲， 陈国梁， 龚 雷 ， 宋锦浩， 郝婉怡， 马卓裕(.榆林市榆阳区林业工作站， 陕西 榆林 79000； .延安大学生命科学学院， 陕西 延安 76000；.东北农业大学资源与环境学院， 黑龙江 哈尔滨 5000)

长柄扁桃(Amygdaluspedunculata)别称巴丹杏、野樱桃、毛樱桃，在我国有1 300多年的栽培历史，其抗旱、抗寒能力极强，其种质资源较为丰富，主要分布种植在我国西北干旱、半干旱山地区域，尤其在内蒙古、河北和陕西等地分布最广[1-3]，在西伯利亚地区也有分布[4]。长柄扁其根系发达，能够适应多种土壤类型和土壤湿度条件，是用于防治土壤沙化的首选树种之一，成林之后能够达到长效治沙的目的[5-6]。长柄扁桃还是我国重要的生态经济型树种，具有潜在的经济价值和药用价值，其富含蛋白质、脂肪、氨基酸及微量元素等，其果仁含油率高，出油率高达45%～55.8%[7-8]。不饱和脂肪酸含量也高达98.1%，其含量与橄榄油相近，完全达到了食用油的标准，具有较高的开发价值潜力[9-11]。另外，临床上常采用长柄扁桃叶子的提取物进行杀灭指环虫，其种子(含苦扁桃球蛋白氢氯化物)也可制作为治疗病毒性感冒的中药，因此长柄扁桃也具有很高的药用价值。

长期以来，长柄扁桃一直处于野生状态，而近年来我国西北部的干旱和半干旱地区已对其进行基地建设和资源开发利用，目前已成为国家木本油料重点研究和发展的对象[12-14]。同时，中外学者研究了长柄扁桃在抑制心脑血管疾病及提取成新型的植物蛋白方面都取得了很大进展，特别是在化学成分、营养学以及药理学方面均有广泛报道[15-17]。

目前，在人们关注长柄扁桃造林技术与药用价值的同时，很少注意到不同品种的长柄扁桃生理性状的变化,尤其在旱作地区对于长柄扁桃的抗旱酶系的研究几乎为空白。近年来，关于长柄扁桃的蛋白质组分和酶已陆续有一些究报道。有研究表明,不同种源长柄扁桃在相对含水量、质膜透性、可溶性蛋白、丙二醛及过氧化氢酶等指标差异较大[18]。但在干旱环境下不同品种植物会有不同的生理特征，尤其在菌剂处理下植物的抗旱酶系方面鲜见报道。因此，本试验以四种长柄扁桃为研究对象,探究不同浓度枯草芽孢杆菌菌剂对长柄扁桃叶片谷胱甘肽S-转移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和可溶性糖(SS)等生理指标的影响，旨在为揭示长柄扁桃抗旱机理提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以榆林榆阳区巴拉素镇的多年生长柄扁桃苗木为试验材料，4种长柄扁桃分别为丰宁坝下群体3号、固阳群体1号、神木群体22号、榆阳群体19号。

菌剂为SL-19枯草芽孢杆菌菌剂(鄜州神鹿有限公司生产)。

1.2 试验地概况

试验地位于榆林市榆阳区巴拉素镇(38°14′N, 109°18′E)，该地处毛乌素沙丘南缘风沙草滩地带，该地带地势平缓、大多为波状起伏固定、半固定沙丘，土壤类型为风沙土。年平均降雨量423 mm，降雨主要集中在6—9月，约占全年降雨量的80%以上，平均海拔高度为1 067 m，年平均气温7.6 ℃，年均蒸发量896 mm。该地区日照充足，干旱和霜冻等灾害频繁发生。地貌类型为沙质土壤。

1.3 试验方法

长柄扁桃种植株行距为2 m×6 m，栽植时坑深为50 cm，宽为40 cm，栽植密度为55株/667 m2。栽植深度以35 cm为宜，地上留苗高5 cm。栽植时将土和肥料按200∶1的比例混匀，将苗木根部完全沾到泥浆，进行造林。试验共设4个不同浓度枯草芽孢杆菌菌剂处理：(i)对照(ck)；(ii)施用3 g/L枯草芽孢杆菌菌剂；(iii)施用6 g/L枯草芽孢杆菌菌剂；(iv)施用9 g/L枯草芽孢杆菌菌剂；(v)施用12 g/L枯草芽孢杆菌菌剂。在花期前进行5个试验处理，用同一浓度的枯草芽孢杆菌菌剂灌浇长柄扁桃，每5 d灌施一次，保持土壤水分充足，持续处理35 d，根据叶片特征变化测定抗旱酶生理生化指标，测定重复3次。

1.4 测定项目与方法

选取长柄扁桃上部的第4～5片功能叶，置于-80 ℃保存用于测定。SOD活性测定采用氮蓝四唑光化还原法，POD活性测定选用愈创木酚法，CAT活性测定采用紫外吸收法，MDA测定用双组分光光度法、SS含量测定用分光光度计法。

1.5 数据处理与统计分析

试验数据采用Origin 2021和SPSS软件进行作图、统计分析。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌菌剂对不同品种长柄扁桃GST活性的影响

谷胱甘肽S-转移酶(GST)是植物代谢的关键酶，在遭受胁迫时，GST可清除活性氧，保护植物细胞膜结构和蛋白质活性。从图1中可以看出，丰宁坝群体3号的GST活性为330～703 nmol/(g·min)，固阳群体1号的GST活性为302～678 nmol/(g·min)，神木群体22号的GST活性为280～640 nmol/(g·min)。在ck处理条件下，榆阳群体19号GST的酶活性最低，为272 nmol/(g·min)，在枯草芽孢杆菌浓度最高时榆阳群体19号GST活性取得最低值，为603 nmol/(g·min)。综上，4个长柄扁桃品种的叶片GST活性均随枯草芽孢杆菌浓度的升高而逐渐提高，并在枯草芽孢杆菌菌剂9 g/L浓度条件下达到最高，之后随之降低。丰宁坝下群体3号GST活性要普遍高于其他3种品种，固阳群里1号次之，榆阳群体19号最低。

图1 不同浓度枯草芽孢杆菌菌剂对长柄扁桃叶片GST活性的影响Fig.1 Effects of different concentrations of bacillus subtilis on glutathione S-transferase (GST) in Amygdalus pedunculata

2.2 枯草芽孢杆菌菌剂对不同品种长柄扁桃SOD、POD、CAT活性的影响

从表1可看出，4种长柄扁桃品种的SOD、POD和CAT活性随枯草芽孢杆菌菌剂浓度的升高而呈先升后降的趋势，当枯草芽孢杆菌菌剂浓度达9 g/L，4个品种酶活性均为最高。而随着枯草芽孢杆菌浓度升高时，4种品种的SOD、POD和CAT活性均逐渐降低。其中，当ck处理时,榆阳群体19号在SOD、POD和CAT为最低,最高的CAT活性是固阳群体1号，SOD活性最高为丰宁坝下群体3号，而最高POD活性是神木群体22号。其中，当枯草芽孢杆菌菌剂浓度在9 g/L时，丰宁坝下群体3号的SOD、POD和CAT活性为最高。

表1 不同枯草芽孢杆菌菌剂浓度处理下不同长柄扁桃叶片酶活性的影响Table 1 Effects of different concentrations of bacillus subtilis on enzyme activities in Amygdalus pedunculata leaves

在SOD活性上，当枯草芽孢杆菌浓度在9 g/L时，丰宁坝下群体3号较固阳群体1号、神木群体22号和榆阳群体19号分别高8.42%、14.2%和17.07%(表1)。而在0～12 g/L枯草芽孢杆菌处理时，SOD活性排序为丰宁坝下群体3号>固阳群体1号>神木群体22号>榆阳群体19号。

在POD活性上，当枯草芽孢杆菌菌剂浓度为0～6 g/L时，固阳群体1号均高于其他3个品种。当枯草芽孢杆菌菌剂浓度为9～12 g/L时，固阳群体1号微低于丰宁坝下群体3号，高于神木群体22号和榆阳群体19号。在CAT活性上，当枯草芽孢杆菌菌剂浓度为9 g/L时，丰宁坝下群体3号较固阳群体1号、神木群体22号和榆阳群体19号分别高15.3%、18.9%和19.5%。从枯草芽孢杆菌菌剂浓度为0～12 g/L时，其排序为丰宁坝下群体3号>固阳群体1号>神木群体22>榆阳群体19号(表1)。

2.3 枯草芽孢杆菌菌剂对不同品种长柄扁桃可溶性糖(SS)含量的影响

从图2中可以看出，不同浓度枯草芽孢杆菌对长柄扁桃叶片的SS含量具有显著影响。当枯草芽孢杆菌浓度0～12 g/L，丰宁坝群体3号的SS含量范围为2.3～3.5 mg/g，神木群体22号SS含量为1.8～3.1 mg/g，榆阳群体19号的SS含量为2.6～4.1 mg/g，丰宁坝群体3号的SS含量为2.6～4.1 mg/g。4个品种的SS含量均随着枯草芽孢杆菌浓度升高逐渐升高，当枯草芽孢杆菌浓度最高时，4个品种的SS含量达到最高。当枯草芽孢杆菌浓枣为0～12 g/L，SS含量在丰宁坝群体3号最高，固阳群体1号次之，较低的是神木群体22号和榆阳群体1号，两者之间在各个枯草芽孢杆菌浓度下差异不显著。

图2 不同浓度枯草芽孢杆菌菌剂对长柄扁桃的SS的影响Fig.2 Effects of different concentrations of bacillus subtilis on soluble sugar (SS) in Amygdalus pedunculata

2.4 长柄扁桃生理生化指标相关性分析

通过不同抗旱酶系组分的Spearman等级相关分析表明(图3)，GST与SOD呈极显著的正相关关系(p<0.01)，POD与CAT之间呈极显著的正相关关系(p<0.01)，SS与POD呈显著正相关关系(p<0.01)。

图3 长柄扁桃的抗旱酶系因子的相关性分析Fig.3 Correlation analysis of drought resistance enzymes in Amygdalus pedunculata

2.5 不同品种长柄扁桃的净光合速率日变化

以9 g/L枯草芽孢杆菌施用条件下为例，研究了4种长柄扁桃的净光合速率日变化。由图4显示，4个品种的叶片均在晴天条件下净光合速率呈“双峰型”曲线，长柄扁桃叶片在09：00时净光合速率(Pn)较低，其中最低的是神木群体22号为7.9 μmol CO2/(m2·s)。随着温度上升和光照逐渐增强，从09：00—13：00时之间，4种长柄扁桃的Pn处于显著增加的趋势(图3)。至13：00时，长柄扁桃叶片Pn达到最高是固阳群体1号，为22.2 μmol CO2/(m2·s)。在13：00—14：00时之间，4种长柄扁桃叶片在此时段中(Pn)出现持平并略微下降趋势，尤其榆阳群体19下降到17.6 μmol CO2/(m2·s)。从14：00—16：00时，长柄扁桃的Pn呈现明显下降趋势。至18：00时，长柄扁桃叶片Pn开始继续下降，最低达到9.8 μmol CO2/(m2·s)(榆阳群体19号)。也就是说，随着温度和光照强度的减弱，长柄扁桃进行光合作用变少，因此在这个时段Pn出现明显下降趋势。研究表明，长柄扁桃对于光较敏感，尽管在同一浓度的枯草芽孢杆菌菌剂浓度下，不同品种长柄扁桃类型通过叶片进行光合作用也具有很大差异。

图4 不同品种长柄扁桃的(Pn)的日变化Fig.4 Diurnal variation of net photosynthetic rate of Amygdalus pedunculata in different cultivars

3 讨 论

适中浓度枯草芽孢杆菌添加时，显著增强长柄扁桃的抗旱性。长柄扁桃作为是我国荒山造林和生态建设的优选树种[19-20]，可承受干旱程度较高土壤[21-23]。而筛选最宜旱地造林的长柄扁桃品种及促进抗旱的枯草芽孢杆菌的浓度，对于探明长柄扁桃抗旱原理具有重要意义。

本研究表明，不同浓度枯草芽孢杆菌对4种品种长柄扁桃的GST、SOD、POD、CAT的活性及可溶性糖含量均有显著提升作用。这与枯草芽孢杆菌菌剂中所含的大量有效活菌密切相关，枯草芽孢杆菌可以增加多种酶合菌类物质，通过吸收土地的养分和水分提升长柄扁桃体内的碳水化合物，从而提升植物的抗逆性，因此形成高度抗旱的内生孢子来抵抗逆境环境。本研究发现，4种品种的GST、SOD、POD、CAT均随枯草芽孢杆菌浓度的升高而逐渐提高，并在枯草芽孢杆菌9 g/L浓度条件下达到最高，之后随之降低，说明枯草芽孢杆菌浓度过高时，对长柄扁桃的抗旱酶却有抑制作用。在0～12 g/L枯草芽孢杆菌浓度范围内，4种长柄扁桃的抗旱效果依次为：丰宁坝下群体3号>固阳群体1号>神木群体22号>榆阳群体19号。因此，在品种生理生化适应性方面，当丰宁坝下群体3号和固阳群体1号受到干旱胁迫后，能够更好地优于神木群体22号和榆阳群体19号。尤其当细胞膜受损或受到电解质外渗等因素影响，较好品种的长柄扁桃其体内会快速积累谷胱甘肽S-转移酶、可溶性糖等渗透调节物质，来降低体内的渗透势，使其在逆境下仍可获得维持正常生长所需的水分[24-26]，因此，不同长柄扁桃品种间抗旱酶均有显著差异。

而同一枯草芽孢杆菌浓度下不同品种长柄扁桃的净光合速率日变化也证明了这一特性。通过对Pn的研究，目的是为分析不同品种长柄扁桃的光合生产力和叶片生理作用形成提供理论依据。研究表明，在上午时段4种长柄扁桃的Pn均较低，而进入中午时段(为一天中光照强度和温度最高的时段)，叶片进入光合作用的旺盛期，此时丰宁坝下群体3号和固阳群体1号Pn均较高。随着时间至14：00时，叶片也会遇到“午休”，长柄扁桃Pn发生持平。随着光照强度减弱，光合作用变少，长柄扁桃Pn不断出现下降趋势，因此至18：00时左右，最低Pn是榆阳19号。

综合分析表明，在9 g/L枯草芽孢杆菌浓度时，4种长柄扁桃的抗旱酶系均达到最高，其中丰宁坝下群体3号的抗旱酶活性为最高和叶片光合能力最强，榆阳群体19号的抗旱性和叶片发生光合能力最弱。因此，在毛乌素沙丘地带更适宜栽植丰宁坝下群体3号，配施适宜浓度枯草芽孢杆菌菌剂更有益于长柄扁桃旱地造林。