Kallistatin 及HMGB-1 在间质性肺炎中的诊断及临床意义

李传浩，唐伟，王鹤鸣，周强

（安徽医科大学第二附属医院检验科，安徽 合肥 230601）

0 引言

间质性肺疾病（ILD）亦称间质性肺炎，是一组主要累积肺间质和肺泡腔，导致肺泡- 毛细血管功能单位丧失的弥漫性肺疾病。ILD 可最终发展为弥漫性肺纤维化和蜂窝肺，导致呼吸衰竭而死亡[1]。ILD 目前主要通过临床症状如咳嗽、胸闷、通气、扩散功能障碍和限制性通气功能障碍和肺功能测试以及高分辨率CT（HRCT）进行联合诊断[2-3]。然而，ILD 患者在出现临床症状时，其肺部结构也会出现严重的改变。因此早期诊断不仅有助于更好地确定治疗方案，而且有助于改善其预后。

高迁移率组框蛋白1（HMGB-1）是一种多功能细胞因子，通过与特定细胞表面受体结合，参与感染、炎症、凋亡和免疫反应的基本过程[4-6]。更重要的是，HMGB-1 可能参与纤维化疾病，包括肺纤维化[7]。

人组织激肽释放酶结合蛋白（Kallistatin）是一种血浆蛋白和一种新型的组织激肽释放酶抑制剂[8]。Kallistatin 有多种功能，具有抗血管生成、凋亡、炎症和氧化应激的活性[9-10]。有研究表明，Kallistatin 通过抑制血管生成和炎症进而抑制肺纤维化进程[11]。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021 年4 月1 日至2021 年7 月31 日在安徽医科大学第二附属医院就诊确诊的ILD 患者54 例，参考美国呼吸协会/欧洲呼吸协会制定的分类标准[12]，ILD 通过临床症状及典型HRCT 表现诊断，排除标准为恶性肿瘤、慢性阻塞性肺疾病、重症肺炎、肝肾疾病。选取同期在医院体检中心体检的健康人群40 例。本研究经安徽医科大学第二附属医院伦理委员会批准，所有患者及家属均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

血清Kallistatin ELISA 试剂盒（E-EL-H5550c）及HMGB-1 ELISA 试 剂 盒（E-EL-H1554c）均来自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司（Elabscience），酶标仪采用KHB 科华生物酶标仪ST-360 型。

1.3 方法

1）收集患者及健康人群空腹全血，并以室温下4000 r/min 离 心5 min 制 备 血 清，于-80 ℃冰箱中保存备用；2）收集研究对象的基础资料：性别、年龄；3）检测血液常规指标：白细胞绝对计数（White blood cell counts,WBC）、中性粒细胞绝对 计 数（Absolute neutrophil count，ANC）、单 核细胞绝对计数（Absolute monocyte count，AMC）、淋巴细胞绝对计数（Absolute lymphocyte count，ALC）、血小板计数（Platelet，PLT）、中性粒细胞/淋巴细胞（Neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR）、单核细胞/ 淋巴细胞（Monocyte-to-lymphocyte ratio,MLR）、血 小 板/ 淋 巴 细 胞（Platelet-tolymphocyte ratio，PLR）；4） 血 清Kallistatin 及HMGB-1 水平分别采用Kallistatin 检测试剂盒及HMGB-1 检测试剂盒通过ELISA 法定量检测，并在450 nm 处用酶标仪测量标准品及样品吸光度（OD），制作标准曲线；5）检测ILD 患者肺功能相关指标：肺总量（Total lung volume,TLC）、一氧化碳弥散量（diffusing capacity of lungs for carbon monoxide,DLCO）实预比、用力肺活量（Forced vital capacity,FVC）实预比、第1 秒用力呼气容积（Forced expiratory volume in one second, FEV1）实预比、肺活量（vital capacity，VC）。

1.4 ILD 的分期系统和疾病严重程度评估

目前ILD 的分期系统和疾病严重程度主要采用综合生理指数（Composite physiologic，CPI）和ILD-GAP 评 分[13]。CPI= 91-（0.65×DLCO预测值百分比）-（0.53×FVC 预测值百分比）+（0.34×FEV1预测值百分比）。

1.5 统计学处理

用SPSS 23.0 软件进行数据分析。连续变量若符合正态分布则用±s 表示，采用t检验进行比较，若不符合正态分布则用P50（P25,P75）表示，采用Mann-Whitney U 检验，P＜0.05 被认为差异有统计学意义。通过构建ROC 曲线比较Kallistatin 及HMGB-1 的诊断效能，并用Z 检验比较不同ROC曲线下面积（AUC）。采用Pearson 相关性分析比较Kallistatin 及HMGB-1 水平与ILD 严重程度的相关性。

2 结果

2.1 ILD 患者和健康对照组的临床特征

54 例ILD 患者和40 例健康对照者的人口学和临床特征见表1。ILD 患者男和健康对照组在性别、年龄、WBC、AMC、PLT 等方面差异无统计学意义（P＜0.05）。而两组间在NLR[3.18（1.89,4.58）vs1.72（1.30,2.10）]、MLR[0.32（0.24,0.42）vs0.22（0.17,0.26）]、PLR[134.66（95.78,205.74）vs 96.04（78.87,131.27）]方面差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 ILD 患者及健康对照组临床特征

2.2 ILD 患者肺功能特征

在54 例ILD 患者中有33 例患者进行肺功能实验，统计患者的肺功能相关指标如表2，患 者VC 平 均 值 为76.72%±19.11%、FVC平 均 值 为78.60%±19.90%、TLC 平 均 值 为79.00%±29.27%、FEV1 平均值为（79.56±19.40）、MEF25 平均值为（64.40±32.99）、MEF50 平均值为（77.68±24.50、DLCO 平均值为（66.37±23.43），均小于正常值。RV/TLC 平均值为（51.63±13.24），大于正常值。在33 例行肺功能检测的患者中，有20 例患者FVC 占预计值%＜80%（60.6%），26 例患者DLCO 占预计值%＜80%（78.8%）。

表2 ILD 患者的肺功能指标

2.3 ILD 患者与健康对照组的血清Kallistatin 及HMGB-1 表达水平

根据ELISA 结果显示，ILD 患者血清Kallistatin水平[3.44（2.20-6.28）] 高于健康对照组[2.29（1.39-3.28）]，ILD 患者血清HMGB-1 水平[19.31（6.78,43.99）]显著高于健康对照组[6.9（34.65,10.06）]，差异均有统计学意义（P＜0.05），如图1。

图1 ILD 患者与健康对照组的血清Kallistatin 及HMGB-1表达水平

2.4 血清Kallistatin 水平及血清HMGB-1 水平对ILD 的诊断效能

以健康体检者为对照组绘制ROC 曲线，评估血清Kallistatin 水平及血清HMGB-1 水平单独用于诊断ILD 的效果，如图2。通过绘制ROC 曲线分析，血清Kallistatin 水平及血清HMGB-1 曲线下面积为0.701(95%CI :0.596-0.845，P＜0.001) 和0.748（95%CI :0.649-0.848，P＜0.001）。血清Kallistatin预测ILD 患者的临界值为5.36μg/mL（敏感性33.3%，特异性97.5%），血清HMGB-1 预测ILD 患者的临界值为13.92 ng/mL（敏感性55.6%，特异性97.5%）。

图2 Kallistatin 及HMGB-1 诊断ILD 的ROC 曲线

2.5 血清Kallistatin 水平及血清HMGB-1 水平与ILD 患者严重程度的相关性

54 例ILD 患者中有33 例患者行肺功能测试，4 例因呼吸衰竭无法行肺功能检测。按照综合生理指数（CPI）及ILD-GAP 评分对ILD 的严重程度进行评估，并分别与血清Kallistatin 水平及血清HMGB-1 水平进行Pearson 相关性分析，如表3显示，血清HMGB-1 水平与ILD 的严重程度有较强 的 正 相 关 性（CPI：r=0.455，P＜0.05；ILD-GAP：r=0.506，P＜0.05）。而血清Kallistatin 水平与ILD的严重程度不具有相关性。

表3 Kallistatin、HMGB-1 与ILD 严重程度相关性分析

3 讨论

ILD 是一组弥漫性间质性改变的疾病，以临床病情严重、预后差为特点。目前对ILD 的诊断方法主要基于临床症状、肺功能指标和影像学检查[14-15]。然而，仅仅依靠这些技术，某些ILD 依旧无法进行早期确诊。并且，肺功能检查受多种因素影响，反复的影像学检查可能对患者造成辐射损伤[16-17]。目前尚无有效的生物标志物可对于ILD进行早期诊断和病情监测，因此，需要简单有效的生物标志物来实现ILD 的早期诊断和病情评估。

kallistatin 是一种内源性蛋白质，广泛分布于与心血管功能相关的组织中，包括肝脏、肾脏、心脏和肺。我们的研究发现ILD 患者血清kallistatin水平相对于健康对照组偏高，提示kallistatin 可能与ILD 的发病相关。既往研究显示，kallistatin 通过其两个结构元件：活性位点和肝素结合域，调节不同的信号通路和广泛的生物活性，通过其肝素结合位点可以阻断TGF-β 诱导的多种器官纤维化，比如心脏、肝脏和肾脏[18-20]。因此我们认为ILD患者血清kallistatin 水平偏高可能是机体的自我保护机制，通过上调kallistatin 的表达来抑制肺纤维化的进程。这跟在博来霉素诱导的特发性纤维化大鼠实验中，高kallistatin 水平可以改善博来霉素诱导的肺纤维化相吻合[11]。通过构建ROC 曲线分析显示，血清Kallistatin 水平曲线下面积为0.683(95%CI :0.574-0.792，P=0.002)，其预测ILD患者的临界值为4.02 μg/mL，敏感性为42.6%，特异性为90%。虽然Kallistatin 诊断ILD 敏感性低，但是其诊断特异性较高，因此kallistatin 可以作为诊断ILD 的新型血清生物标志物。本研究还评估了血清kallistatin 水平与ILD 疾病严重程度CPI 和ILD-GAP 评分的相关性，结果提示血清kallistatin水平与ILD 疾病严重程度无明显相关性。

HMGB-1 是一种损伤相关分子模式，存在于所有哺乳动物细胞的细胞核中，在损伤、感染或其他炎症刺激下由坏死细胞释放，或由活化的巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞分泌[21]。当细胞外HMGB-1 与宿主靶细胞的特定受体结合时，它会触发炎症介质的释放，并在炎症反应中发挥重要作用[22]。在本研究中ILD 患者血清HMGB-1水平相对于健康人群表达升高，提示HMGB-1 参与患者ILD 的发生。其机制是HMGB-1 通过促进TGF-β1 释放来诱导上皮- 间质转化和肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，肌成纤维细胞产生大量的细胞外基质，导致肺纤维化[23-24]。并且既往研究显示HMGB-1 参与多种器官纤维化的发病机制，抑制HMGB-1 的表达可以减缓纤维化的发生发展，如肝脏、肾脏和心脏[25-30]。同样通过绘制ROC 曲线，血清HMGB-1 曲线下面积为0.719(95%CI:0.616-0.828，P＜0.001)，其 预 测ILD患者的临界值为18.1 ng/mL，敏感性为51.9%，特异性为92.5%。血清HMGB-1 可以作为诊断ILD的特异性血清生物标志物。此外，本研究还发现血清HMGB-1 水平与ILD 严重程度呈较强的正相关性（CPI：r=0.455，P＜0.05；ILD-GAP：r=0.506，P＜0.05），这表明血清HMGB-1 水平可以预测患者ILD 的严重程度。

综上所述，ILD 患者血清HMGB-1 与Kallistatin的水平显著升高，未来可以成为辅助诊断ILD 新的生物标志物；且血清HMGB-1 水平与ILD 患者的严重程度呈较强的正相关性，HMGB-1 可成为预测ILD 进展程度的一种新的指标。