circRNA 在胃癌中的研究进展

朱怡臻，贾西云，冯智慧，傅聿铭

(郑州大学第五附属医院,河南 郑州 450052）

0 引言

胃癌在全世界范围每年大约有100 万新发病例，死亡率约为80%[1]。我国胃癌发病率已趋于平稳,但总发病数还将随人口老龄化的加剧而增加。胃癌具有发病隐匿，早期难确诊，易转移，复发率高等特点。目前胃癌的诊断仍旧是主要依靠内镜手段来确诊；然而，内镜检查有其局限性和滞后性，往往会延误最佳诊断和治疗的时机。经典的胃肠道肿瘤标记物如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）或 糖 类 抗 原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）等相关肿瘤抗原的器官特异性均较低，对肿瘤的特定类型区分缺乏特异性和敏感性。为能早期诊断胃癌，改善胃癌的中晚期难治与较差的预后，寻找新的肿瘤标志物成为了胃癌研究的重要任务。

circRNA 的发现已经有20 多年的历史，伴随高通量技术的快速发展及大量应用，它神秘的面纱逐渐被揭开：circRNA 具有高度的序列保守性和稳定性，没有5′帽和3′尾,不易被核酸外切酶降解[2]。以共价键形成闭合环状结构的circRNA，具有丰富的生物学作用，在转录或转录后水平发挥调控基因表达的作用。近几年来，通过大量研究人们对circRNA 的认识不再只停留在“剪接的副产物”上，而认为其与许多疾病和各种肿瘤的发生、发展密切相关。作为当下的研究热点，circRNA 拥有稳定的结构并广泛存在于真核生物细胞中，除通过血液直接检测外，已有研究报道它也大量存在于外泌体中，以其作为新的生物标志物来诊断胃癌和判断预后有巨大潜力。深入研究胃癌与circRNA 之间的关系，有助于更多地阐明胃癌发生、发展的分子机制，并为胃癌寻找新的临床靶向治疗方法提供可能。

1 circRNA 的概述

最初，circRNA 被普遍认为是由于错误的剪切拼接形成的。伴随着对RNA 环化的深入研究，越来越多报道证明circRNA 具有复杂且灵活的剪接机制[3]。根据目前已有的报道，由于来源序列和形成方式的不同，可将主要的circRNA 分为以下4 种：外显子序列形成的circRNA（exonic circular RNA,ecircRNA)、内含子序列形成的circRNA（circular intronicRNA,ciRNA）、外 显 子序列和内含子序列共同形成的circRNA(exonintron circRNA,EIciRNA)、以 及 转 运RNA(transfer ribonucleic acid,tRNA)内含子在tRNA 剪接前体时形 成 的circRNA(tRNAintroniccircRNA，tricRNA)，其中人类组织细胞中的circRNA 主要为单个或多个外显子形成的ecircRNA。此外，环状DNA 核胞病毒也可以形成circRNA。

不同于线性RNA 的经典剪接，这些circRNA的拥有各自的形成机制：ecircRNA 是单个或多个外显子通过直接反向拼接（back-splicing）机制或外显子跳跃（exon skipping）机制形成的，可分别由5′或3′发起反向拼接形成，内含子被核酸分支酶切除后，5′端/3′端剪接供体与3′端/5′端剪接受体相结合，产生环状的外显子套索[4,5]。ciRNA 通过套索驱动（lariat-driven）环化生成，其在5′剪接位点附近有一段7-nt 左右富含GU 碱基的序列，而在分支点附近存在一段11-nt 富含C碱基的片段，由于该保守序列的存在，使ciRNA 得以避免了脱支酶和核外降解，同时，该关键序列是ciRNA 进行正常环化所必需的[6]。EIciRNA 的形成机制仍未完全清楚，但是已有文献报道EIciRNA的侧翼互补序列（尤其是ALU 序列）在外显子环化中起着重要作用，通过内含子之间的碱基互补配对，由前体mRNA（precursor messenger RNA，premRNA）形成的[7]。ecircRNA 和EIciRNA 在结构上仅存在着是否保存内含子序列的差异，由于剪接发生位点和剪接方式选择的不同，两者之间存在着相似的发生机制。tricRNA 是由tRNA 前体上的内含子通过剪接形成的[8]。

除上述描述的circRNA 形成方式外，RNA 结合蛋白（RNA binding protein，RBP）对circRNA 的环化也有驱动作用：RBP 可通过与侧翼内含子结合，使供体和受体位点结合，从而驱动环化[9]。肌盲（muscleblind）蛋白，作为RBP 可参与circmbl的形成[10]。因此，RBP 对部分circRNA 的形成有重要意义。

2 circRNA 的分子功能

过去观点认为circRNA 仅作为ncRNA（noncoding RNA，ncRNA）：几乎没有开放阅读框（open reading frame，ORF），无法翻译蛋白质。现有研究发现，部分特定的ncRNA 可以在特定的组织中被翻译[11]。某些circRNA 具有起始密码子序列（AUG位点）和内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES），这也就在一定程度说明其具备招募核糖体并进行翻译功能的潜力[12]。

作为内源竞争性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），发挥miRNA 海绵作用，是circRNA目前最典型的一个功能[13]。小脑退化相关蛋白1 反义转录物（antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript，CDR1as），也称ciRS-7（circular RNA sponge for miR-7）是经典的miRNA 海绵，其包含74 个miR-7 的结合位点，可同时结合大量的miR-7，对miR-7 起负调控作用[14]。当ciRS-7 过表达时，其对miR-7 的抑制作用增强，miR-7 的下游靶基因表达水平将上升，而抑制ciRS-7 的表达就会解除了对miR-7 的海绵作用，从而导致miR-7 作用的靶基因表达被抑制。ciRS-7 的MRE 与miR-7 的竞争性结合，可促进胰岛素分泌，影响中脑神经组织发育，并参与结肠癌、肝癌发展的机制[15]。circRNA 可通过抑制阿格蛋白2（argonaute2，AGO2）与miRNA 的接触，影响其复合靶向体对其他RNA 的调节[16]。Sry（Sex-determining region Y）基因相关的睾丸特异性circRNA 包含16 个miR-138 的结合位点，拥有与ciRS-7 相似的调节机制，与miR-138 的相互作用从而调节miR-138 靶基因的表达[17]。circRNA 也可以同时是多种miRNA 的海绵：位于HIPK3 基因上的exon2 环化成的circHIPK3，目前已知其可以结合9 种miRNA，并且找到18 个潜在位点，作为“海绵”可特异性结合miR-124 并抑制其功能，从而促进肿瘤细胞的增殖[18]。

3 circRNA 与胃癌

胃癌确诊时间的早晚直接决定了患者的预后，早期胃癌患者多因无明显症状而错过手术时机。寻找新的诊断方法与预后评估指标，是当今胃癌研究的重点。现已证实许多circRNA 参与并影响了胃癌的发生、发展，它们在胃癌中的差异表达，可为我们对胃癌的研究提供新思路。本文汇总了部分胃癌相关的circRNA，见表1。

表1 胃癌相关circRNA

3.1 circRNA 与胃癌的发生发展

许多实验研究已经证明circRNA 可在转录或转录后水平调节基因的表达。在胃癌中，circRNA被阐述最多仍是作为其他生物分子的“海绵”。ciRs-7/miR7 调节轴影响了胃癌细胞的增殖，miR7具有抑癌作用并在胃癌肿瘤细胞中低表达[30]。Pan 等[19]报道了过量表达的ciRs-7 结合了大量的miR7，从而引起后者的低表达，抑制其抑癌作用，此外还加强了PTEN/PI3K/AKT 通路，最终导致胃癌细胞的增殖。PTEN/PI3K/AKT 被认为参与有氧糖酵解[31]，由此推断ciRs-7 可能具备调节胃癌细胞代谢的功能。相似的是，ciRs-7 的过表达也在结直肠癌中发挥类似作用，Weng 等[32]通过研究发现了过表达的ciRs-7 下调miR7 活性也存在于结肠癌细胞中，并通过增强EGFR/RAF1/MAPK 通路来促进肿瘤细胞增殖。circLARP4 是La 核糖核蛋白结构域家族成员4（La ribonucleoprotein domain family member 4，LARP4）的一员，通常在胃癌细胞中低表达的它可作为miR-424 的海绵，使后者的作用靶点巨大肿瘤抑制基因激酶1（large tumor suppressor kinase 1，LATS1）的抑制解除从而表达上调，这一过程可使胃癌细胞的增殖受到抑制，表明circLARP4 具有抑癌调控作用，侵袭实验提示过表达的circLARP4 具备抑制胃癌细胞侵袭的功能[25]。circPVT1 作为miR-125 的海绵并在胃癌细胞中高表达，影响其与靶基因EFE2 的结合，失去miR-125 抑制的靶基因表达水平明显上升，这一过程可促进胃癌细胞的增殖[33]。Liu 等[34]研究表明，circYAP1 具有抑制胃癌细胞增殖和侵袭的作用并在胃癌组织中低表达，且circYAP1 低表达的胃癌患者获得了更长的存活时间。Zhang 等[35]发现，hsa_circ_100269 在胃癌组织中低表达，上调该circRNA 后可抑制胃癌细胞的增殖，其作用机制与circRNA100269/miRNA630 信号通路相关。Zhao等[36]发现hsa_circ_0000181 在胃癌细胞和血浆中均为低表达，其与肿瘤直径、淋巴结转移、远处转移以及糖类抗原CA19-9 水平相关。Tang 等[37]验证了在胃癌组织中低表达的circ-KIAA1244 与胃癌TNM 分期和淋巴转移呈负相关。

综上，circRNA 对胃癌增殖、侵袭、代谢等生物学功能均有调控作用，但其确切的上下游分子靶点及复杂交叉的信号通路还没有完全阐明，需要我们通过更深入的研究来具体诠释。

3.2 circRNA 与胃癌的肿瘤微环境

肿瘤 微 环境（tumor microenvironment，TME）是指除肿瘤细胞本身外的细胞和分子组成的能够影响肿瘤生物学功能的细胞环境。外泌体（exosome）是TME 中肿瘤细胞来源的重要调控因子，它包含miRNA、mRNA、蛋白质等许多生物活性物质，circRNA 也在其中。已有研究报道,hsa_circ_044366 在胃癌细胞外泌体中高表达，可通过吸附miR-29a 而使其表达下调，从而促进血管内皮细胞的迁移、成环和增殖[38]。

除外泌体来源的circRNA 影响胃癌的TME外，肿瘤细胞自身的circRNA 也可影响TME。肿瘤细胞的上皮间质化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）与肿瘤的多种生物学功能密切相关, 其中，胃癌细胞的EMT 与其TME 中的E- 钙黏蛋白（E-cadherin）的减少和波形蛋白的增多相关。Li 等[39]报道了，过表达的circ-104916 能够下调胃癌TME 中的波形蛋白和上调E-钙黏蛋白的含量，这对胃癌细胞的EMT 有抑制作用。Zhao 等[40]验证了胰岛素生长因子受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R) 的 表 达 量 与E-cadherin呈负相关，miR-7 可以抑制IGF1R 从而上调E-cadherin，这个过程可以可部分逆转EMT，从而抑制人胃癌细胞侵袭与转移。由此可推测ciRS-7作为miR-7 的“海绵”，也可对EMT 产生相应影响。

3.3 circRNA 与胃癌的治疗

我们已知circRNA 参与并调节了胃癌发展过程中的众多环节，基于“miRNA 海绵”功能的调节机制出发，影响其下游分子的表达量从而对胃癌细胞产生调控作用。敲低或上调circRNA 的表达量，理论上就可以达到逆转或干扰肿瘤细胞恶性生物学行为的治疗目的。在胃癌中，以部分circRNA 作为肿瘤定向治疗潜在的新靶点，可为患者带来更多增益。

Xie 等[30]验证了miR-7 对表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor，EGFR)的亲本mRNA 有降解作用，这影响了其蛋白质的翻译从而抑制了胃癌细胞的增殖和侵袭。Pan 等[19]验证了在人胃癌裸鼠转移实验中，抑制ciRS-7 表达可降低胃癌细胞生长速率。虽然目前对ciRS-7 在胃癌中的研究还停留在体外实验及动物模型阶段，但ciRS-7 很有潜力成为胃癌治疗的重要靶点。

除了ciRS-7 外，还有许多circRNA 对胃癌的治疗有重要意义。circNRIP1 作为miR-149-5p 的海绵能以AKT1/mTOR 通路影响胃癌细胞的增殖和侵袭[41]。作为叉头框转录因子家族的重要成员，FOXO3 多以抑癌基因在胃癌中发挥作用[42]；Lu等[43]报道了hsa_circ_0001368 具备吸附并抑制miR-6506e5p 的能力，进而解除了miR-6506e5p对FOXO3 的海绵作用，最终可抑制胃癌细胞的增殖和远处转移。Chen 等[27]发现了在胃癌中高表达的circPVT1 可发挥miR-125 海绵的作用，miR-125 作为抑癌基因，敲低circPVT1 的表达量可抑制胃癌细胞增殖。此外，通过简单连接酶人工合成的circRNA 也可发挥抑癌作用，Liu 等[44]在体外合成了抗酶解的人工circRNA 来抑制miR-21 以达到降低胃癌细胞增殖并诱导其凋亡的目的；在miR-21 被抑制后，其下游的抑癌蛋白DAXX 的表达得以上调。

值得注意的是，以circRNA 为基础寻找新的治疗靶点还需要大量的实验验证，盲目地投入使用不仅不能为病人带来治疗获益，还会增加医疗成本。联合传统治疗方式，在兼顾安全性和精确度的前提下，如何选取高特异性的circRNA 并将其治疗方式具体化，是今后研究中亟待克服的难点。

4 展望

circRNA 是RNA 家族中的晚辈，随着高通量测序技术的发展，我们对它的了解也越来越多：作为非编码RNA，它分布广泛、结构稳定、功能多样；作为竞争性内源性RNA，它可以发挥“海绵”作用来调节靶基因的表达。目前对于circRNA 领域的研究仍处于起步阶段，关于circRNA 与胃癌相关的发生机制和生物功能仍有太多的未知，需要不断的探索发现。依据目前已有研究，circRNA 在胃癌与癌旁组织的差异性表达，以及其表达水平与肿瘤的大小、侵袭、远处转移、TNM 分期等有着密切相关性，这使我们看到了circRNA 用于肿瘤早期诊断和预后评估的巨大潜力，以及为胃癌患者提供更多治疗获益的可能性。更深层、全面地揭示circRNA 在调控生命活动中的作用，可为今后胃癌的诊断及临床治疗提供新的思路。