1株降解牦牛血液菌株的分离鉴定

马子豪，向军，纪晓岚，廖庆艳，张福梅，周雪雁，3*

（1．西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730124；2．西北民族大学医学院，甘肃兰州 730030；3．西北民族大学生物医学研究中心，甘肃兰州 730030）

我国畜禽血液年产量可达1.9×109kg，其中含有蛋白 3.6×108kg。原料血液不易储藏、易污染、口感差等特点严重制约了畜禽血液的利用，传统的掩埋、焚烧等物理方法无法很好地利用血液资源，还造成了环境污染[1]。国内外普遍采用喷雾干燥、蒸煮干燥等方法将血液加工成血粉，并通过酸碱水解、微生物发酵、酶解等方法将其中的蛋白质分解为可利用的肽和氨基酸[2]。2001年，《禁止在反刍动物饲料中添加和使用动物性饲料的通知》明文规定禁止在反刍动物饲料中使用动物性饲料，动物性饲料的使用量大幅降低，严重制约了家畜血液的利用。微生物法降解废弃血液是目前公认的血液综合利用的研究方向。微生物法处理后的血液富含氨基酸和短肽，可应用于制备氨基酸肥料，最终实现废弃血液循环利用的可持续发展道路。

1996年，解硫胺素芽孢杆菌被正式命名，目前共3个种[3]。米氏硫胺素芽孢杆菌属于芽孢杆菌科解硫胺素芽孢杆菌属，杆状，为革兰氏阳性菌，芽孢呈椭圆形，芽孢亚端生、近中生、中生、包囊稍膨大，能够在营养琼脂和酪朊大豆琼脂等培养基中生长[4]。目前国内外对米氏硫胺素芽孢杆菌的研究主要集中于分离鉴定[5-6]、生物降解[7-8]、生物防治[9-10]及基因序列[11-12]等方面。本文初次研究米氏硫胺素芽孢杆菌降解牦牛血液的能力，为探究微生物法降解血液提供了一定参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集采集于甘肃省兰州市一屠宰场深度20～30 m处的土样，地理坐标为N 36°03′，E 103°40′。

1.1.2 试验试剂

水解酪蛋白胨（MH）肉汤干粉培养基、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠（天津市光复科技发展有限公司）；黄豆饼粉（北京鸿润宝顺科技有限公司）；氯化钠、无水碳酸钠（天津市大茂化学试剂厂）；水解酪蛋白胨（MH）琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司）、革兰氏染色试剂（博精索拉博科技有限公司）、福林酚试剂（北京索莱宝科技有限公司）、细菌DNA提取试剂盒（TaKaRa-美谷生物科技有限公司）；胰化蛋白胨、酵母提取粉（OXOID公司）；三氯乙酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）、血琼脂平板（郑州安图生物工程股份有限公司）、细菌生化鉴定管（杭州微生物试剂有限公司生产）。

1.1.3 培养基

水解酪蛋白胨（MH）琼脂培养基：可溶性淀粉1.5 g/L、琼脂17 g/L、牛肉浸粉2 g/L、酸水解酪蛋白17.5 g/L。

LB液体培养基：氯化钠10 g/L、酵母提取物5 g/L、胰化蛋白胨10 g/L。

液体发酵培养基：玉米粉4 g/L、黄豆饼粉3 g/L、磷酸氢二钠4 g/L、磷酸二氢钾0.3 g/L。

LB固体培养基：胰化蛋白胨10 g/L、酵母提取粉5 g/L、氯化钠10 g/L、琼脂粉20 g/L。

1.1.4 试验仪器

13395H2XBME显微镜（上海徕卡显微系统有限公司）、电泳仪（北京六一仪器设备公司）、AR224CN电子天平（奥豪斯仪器常州有限公司）、YXQ-LS全自动立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）、微波炉（广东格兰仕公司）、SW-CJ-1F超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、恒温恒湿箱（上海一恒科学仪器有限公司）等。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集采用无菌袋从屠宰场废弃血液存放地采集土壤样品，实验室低温保存柜中冻存；血液样品亦采集自屠宰场。

1.2.2 菌株的纯化筛选

将土壤样品进行10-3～10-5梯度稀释，取200 μL稀释液涂布于血琼脂培养基，37℃培养24 h。挑取溶血环较大的单菌落划线接种于血琼脂平板上，37℃培养24 h直至纯化成功，将有溶血环的菌株按常规方法保存。

1.2.3 形态学鉴定

分离株划线接种于血琼脂平板上，37℃培养48 h，观察菌落颜色、大小、形状、边缘、隆起、透明度等指标。挑取少量菌落革兰氏染色后镜检，在光学显微镜油镜下观察菌体细胞的形状、大小及染色结果[1]。

1.2.4 生化鉴定

挑取纯化单菌落于LB液体培养基，37℃培养24 h。吸取50 μL菌液于硝酸盐还原、氨基酸水解、枸橼酸盐等，按生化鉴定管说明书中条件培养，观察并记录试验结果。

1.2.5 药敏试验

挑取纯化单菌落于LB液体培养基中，37℃培养24 h。吸取150 μL量菌液于水解酪蛋白胨（MH）琼脂培养基中涂布均匀。在LB固体培养基上等间距放置阿米卡星、庆大霉素、链霉素、四环素、多西环素、环丙沙星等药片，37℃培养24 h，观察试验结果。

1.2.6 16S rRNA基因序列鉴定

挑取目标菌株至LB液体培养基，在37℃180 r/min摇床培养10 h。取1.5 mL培养液，使用细菌DNA提取试剂盒，提取菌株NWMCC0050基因组DNA。采用16S rRNA全长引物合成27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，扩增细菌核糖体16S rRNA。将PCR产物送至北京擎科生物技术有限公司进行16S rRNA基因序列的测序。所得序列上传至数据库GenBank，利用BLASTN功能对测序所得16S rRNA基因序列进行同源性的比对，利用MEGA 7.0软件构建相应的系统进化树[13]。

1.2.7 蛋白酶活力测定

取1环细菌接入LB液体培养基，37℃培养18 h，以3%接种量接入80 mL发酵培养基，置于250 mL摇瓶，37℃摇床180 r/min发酵30 h，取上清液，采用福林法检测其中蛋白酶的酶活力[14]。

1.2.8 血液降解效果测定

挑取目标菌株至LB液体培养基，37℃180 r/min摇床培养24 h。另取30 mL牦牛血8 000 r/min离心1 min，加入纯水制备成100 mL血液培养基。培养物按2%接种量接入血液培养基，在37℃条件下培养85 h，测定总氮和游离氮。游离氮的测定依据《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》GB 5009.5—2016中甲醛法，总氮的测定依照其中凯氏定氮法，并计算降解效率[2]。

发酵液降解度（DH）=A/N×100% （1）

式中：A为发酵液中氨基酸态氮含量；N为底物中所含总氮含量。

2 结果与分析

2.1 菌株的形态学鉴定（见图1、图2）

由图1可知，纯化后的菌株为需氧菌，于血琼脂平板培养基上可形成乳白色、不透明、无金属光泽、突起、边缘不整齐的大菌落，在血琼脂平板培养基上培养后可见典型的β型溶血。

图1 菌株NWMCC0050血琼脂平板培养结果Fig.1 Result of blood agar plate culture of strain NWMCC0050

由图2可知，分离株为革兰阳性杆菌，产芽孢，单个、成对或成列排布。根据对分离培养菌形态学特性初步分析，分离株初步判定为芽孢杆菌，并命名为NWMCC0050。

图2 菌株NWMCC0050革兰氏染色结果Fig.2 Gram staining result of strain NWMCC0050

2.2 菌株NWMCC0050生化鉴定结果（见表1）

由表1可知，在生化试验中菌株NWMCC0050可利用麦芽糖、葡萄糖及还原硝酸盐，反应结果为阳性。该菌无法利用乳糖、阿拉伯糖、山梨糖、卫矛醇、甘露醇、水杨素、硫化氢、尿素及肌醇等物质，反应结果为阴性。

表1 菌株NWMCC0050生化鉴定结果Tab.1 Biochemical identification results of strain NWMCC0050

2.3 菌株NWMCC0050药敏试验结果（见表2）

由表2可知，菌株NWMCC0050对14种抗生素的敏感性各不相同：对阿莫西林（AMC30）、头孢噻吩（KF30）、头孢他啶（CAZ30）表现耐药，对红霉素（E15）、氯霉素（C30）、头孢西丁（FOX30）表现中介，对阿米卡星（AK30）、庆大霉素（CN10）、链霉素（S10）、四环素（TE30）、多西环素（DO30）、环丙沙星（CIP5）、克林霉素（DA2）、万古霉素（VA30）等8种药物表现为敏感。药敏试验结果表明，菌株NWMCC0050符合解硫胺素芽孢杆菌的特点。

表2 菌株NWMCC0050药敏试验结果Tab.2 Result of drug sensitivity test of strain NWMCC0050

2.4 菌株NWMCC0050的16S rRNA基因序列鉴定（见图3、图4）

由图3可知，菌株NWMCC0050的DNA提取基因序列条带大约为15 000以上。

图3 提取细菌组DNA琼脂糖电泳凝胶结果Fig.3 Result of agarose gel electrophoresis of DNA extracted from bacteria

使用NCBI中BLAST功能将GenBank数据库中16S rRNA基因序列与菌株NWMCC0050的16S rRNA基因序列进行同源性比较。结果显示，菌株NWMCC0050与Aneurinibacillus migulanusstrain NBRC 15520的序列相似性为99.85%。在BLAST下载与菌株NWMCC0050基因序列最相似的10组菌株的16S rRNA基因序列，通过软件MEGA 7.0进行多重比对并构建系统发育树见图4。

由图4可知，菌株NWMCC0050与解硫胺素芽孢杆菌位于同一个分支，遗传距离较近，鉴定为芽孢杆菌属的解硫胺素芽孢杆菌。

图4 菌株NWMCC0050基因序列的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of NWMCC0050 gene sequence of isolates

2.5 菌株NWMCC0050蛋白酶活力的测定（见图5）

以吸光度值为横坐标，酪氨酸浓度值为纵坐标，绘制标准曲线[13]。

由图5可知，该菌株产蛋白酶活力标准曲线的回归方程为y=0.010 1x+0.000 4，R²=0.999 4。当光密度为1时，计算得酪氨酸质量K=98.61，蛋白酶活力为139.54 U/mL。

图5 酶活标准曲线Fig.5 Standard curve of enzyme activity

2.6 血液蛋白降解效果（见图6）

测得试验组中氨基态氮含量为281.73 g/100 L，血液中总氮含量为2 856.26 g/100 L。通过公式计算得出菌株NWMCC0050对血液的降解率为9.86%。

由图6可知，未降解前的血液呈红色，降解后的血液颜色加深，表明菌株NWMCC0050对血液具有较强的适应性，能够一定程度上降解血液，可作为降解废弃血液的备用菌株。

图6 血液培养基降解前后变化Fig.6 Changes before and after degradation of blood medium

3 讨论

利用微生物法降解屠宰场废弃血液进而制备氨基酸有机肥的关键是筛选产蛋白酶酶活力高、血液降解能力强的菌株。李浩丽等[15]在菜市场新鲜猪血中分离得到1株芽孢杆菌，测定其酶活为150.86 U/mL。Yao等[16]从屠宰场取样分离出1株短小芽孢杆菌，其蛋白酶活力可达35.437 U/mL，当血粉添加量为2.1%时，可降解85%的血红蛋白。陶艳华等[17]从南京某屠宰场分离到1株短小芽孢杆菌，在培养基中降解率达53.64%。

本研究分离得到的解硫胺素芽孢杆菌的蛋白酶活力低于上述几种菌株，推测可能是发酵培养基选择不当、发酵条件有待优化或位于胞内的蛋白酶未能穿过胞外所致。菌株NWMCC0050血液降解效率的提升可通过探究其在血液培养基中的不同生长条件进行逐步优化，之后多种菌株混合培养以及菌酶混合培养也是提升菌株血液降解效率的优良方法。此外，本研究为分离鉴定可降解血液的菌株以及初步探究其血液降解能力提供了一种简单且可供参考的试验方法。

氨基酸肥料是一种新型的生态肥料，其使用范围也将愈发广泛[18]。温明霞等[19]研究表明，喷施氨基酸肥料可增加春梢的果皮亮度及可食率。赵勇[20]研究表明，施用氨基酸肥料的党参可增产2 075 kg/hm2。李廷勋等[21]利用地衣芽孢杆菌和大豆来源的蛋白酶降解家畜血液，制成了1种液态氨基酸肥料，均衡地保留了充足的二重缩氨酸、三重缩氨酸等各种形态的氨基酸，使肥效更加持久；同时采用地衣芽孢杆菌对血液进行前处理，有效减少酶的用量及制备时间，节约了制备的成本，为后续研究提供了一种可行思路。目前，国内外对微生物法降解废弃血液的研究尚不够深入，利用此法制备氨基酸液态肥亟须进一步探究。

4 结论

本研究利用血琼脂平板从甘肃一屠宰场血液浸润土样中分离得到菌株NWMCC0302，根据形态学、生化鉴定及16S rDNA测序分析，鉴定为短小芽孢杆菌。当目标菌株以2%的接种量添加到体积分数为30%的牦牛血液培养基中时，经37℃180 r/min摇床培养85 h可测得其对血液培养基的降解效率达9.86%，具有一定的降解血液能力。