鸡骨草多糖铁修饰工艺优化及其抗氧化活性研究

连帅涛，张苑，司红彬，2*

（1．广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；2．亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁 530004）

鸡骨草是豆科植物广州相思子的带根干燥全草[1]，主要分布于广东、广西，可煲汤、制作凉茶[2]，也可单味或复方形式入药治疗肝炎[3]。鸡骨草多糖（ACP）是鸡骨草的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等多种生物活性[4]。鸡骨草可调节蛋鸡高脂饮食诱导的肝损伤[5]，对蛋鸡脂肪肝出血综合征具有防治效果[6]。夏季炎热，鸡极易在高温环境下产生热应激反应，在日粮中添加ACP能够提高机体抗氧化水平，修复热应激导致的肠黏膜损伤，调节肠道菌群，有效缓解鸡的热应激症状[7]。

通过化学、物理或者生物等方法对多糖分子进行修饰可改变其生物活性[8]。多糖经过铁修饰后具有多糖和铁元素的双重生物活性，免疫、抗氧化等活性有所改变，如北沙参多糖铁[9]、黑木耳多糖铁[10]、孔石莼多糖铁[11]、黄芪多糖铁[12]、大蒜多糖铁[13]以及姬松茸多糖铁[14]等。本试验以ACP和三氯化铁（FeCl3）为原料合成ACP铁复合物（Fe-ACP），探究其最佳合成工艺条件；并通过对DPPH·、OH·和·O2

-的清除能力的考察，以及对氧化损伤细胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量的影响反映Fe-ACP的抗氧化活性，为Fe-ACP的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

硫酸亚铁（天津奥普升化工销售有限公司）；1,10-菲啰啉,一水、无水乙醇、盐酸、三氯化铁（成都科隆化学品有限公司）；氢氧化钠、无水碳酸钠、二水合柠檬酸钠（成都金山化学试剂）；二苯基苦基苯肼（DPPH）、水杨酸、没食子酸、维生素C（分析纯，麦克林试剂）；透析袋（截留分子量为3 500 kDa）、MDA及SOD生化试剂盒、胎牛血清、噻唑兰（MTT）、1640培养基（北京索莱宝科技有限公司）。

LC-10N-50D真空冷冻干燥机（上海力辰邦西仪器科技有限公司）、RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、5810R冷冻离心机（eppendorf公司）、INFINITE 200 PRO酶标仪（TECAN公司）、T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、85-2WS磁力搅拌器（上海沪析实业有限公司）、3111二氧化碳培养箱（赛默飞世尔科技有限公司）、JY92-IID超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、DHG-9023A恒温鼓风烘干箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 ACP的制备

采用水提醇沉法制备ACP[15]。经无水乙醇预处理，鸡骨草在90℃下磁力搅拌器恒温3 h，过滤，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃静置过夜，收集沉淀冻干，即得ACP。

1.2.2 Fe-ACP的制备

称取50～350 mg的柠檬酸钠和100 mg ACP混合，恒温水浴搅拌。反应体系中加入2 mol/L FeCl3溶液和2 mol/L NaOH溶液，反应体系pH值控制在7～8。反应开始出现少量沉淀，待出现大量沉淀且沉淀不再溶解时，停止滴加，继续反应1～5 h。待反应液自然冷却，离心除去沉淀，取上清液加入4倍体积的无水乙醇，4℃静置过夜；离心取沉淀加入去离子水溶解，透析24 h，加入4倍体积的无水乙醇，4℃静置过夜；离心，取沉淀冻干，即得Fe-ACP。

1.2.3 多糖铁含量的测定及铁标准曲线的建立

采用邻菲啰啉显色法测定多糖中铁含量[16]。多糖铁的吸光度与实际的铁浓度呈一定关系，在波长510 nm处检测吸光度，通过标准曲线最终得到多糖含铁量。以吸光度为纵坐标y，铁质量浓度（mg/L）为横坐标x，绘制标准曲线，得到回归方程y=0.070 83x+0.044 31，R2=0.998 5。

1.2.4 单因素试验

设计反应温度（A）40、50、60、70、80、90℃，柠檬酸钠添加量（B）50、100、150、200、250、300、350 mg，反应时间（C）1、2、3、4、5 h等3个单因素试验，筛选最佳反应温度、柠檬酸钠添加量以及反应时间。试验时依次改变上述反应因素之一，固定其他因素，以铁含量为评价指标，考察各因素对Fe-ACP制备工艺的影响。

1.2.5 响应面优化试验设计

根据单因素试验结果，进一步优化合成工艺，选取反应温度（A）、柠檬酸钠添加量（B）、反应时间（C）等3个要素进行响应面考察，采用3因素3水平的响应面分析方法进行试验设计，Design-Expert10软件处理数据。试验因素与水平设计见表1。

表1 试验因素与水平设计Tab.1 Experimental factors and horizontal design

1.2.6 体外抗氧化活性

1.2.6 .1 OH·清除能力

以抗坏血酸为阳性对照，分别在96孔板中加入50µL硫酸亚铁溶液（0.009 mol/L），50 µL水杨酸-乙醇溶液（0.009 mol/L），分别加入50 µL维生素C（VC）溶液、ACP溶液和Fe-ACP溶液（浓度为0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 g/L），空白对照采用蒸馏水代替。上述溶液混匀，加入50 µL的过氧化氢溶液（0.009 mol/L），37℃反应30 min，在510 nm波长处测定吸光值。进行3次重复试验，计算OH·清除率。

式中：A0表示蒸馏水代替样品的吸光度；A表示加入样品溶液的试验孔吸光度；AX表示多糖或多糖铁复合物本身的吸光度。

1.2.6 .2 DPPH·清除能力

DPPH溶于无水乙醇配制0.2 mmol/L溶液；以VC为阳性对照，分别取1 mL ACP及Fe-ACP（浓度分别为2.000、1.000、0.500 0、0.250、0.125 g/L）加入试管；加入4 mL预先配置好的DPPH乙醇溶液，混匀，避光在常温下反应30 min，以蒸馏水代替多糖溶液作为空白对照，在517 nm波长处测量吸光度。平行试验3次，计算DPPH·清除率。

DPPH·清除率=[1-(E2-E1)/E0]×100% （2）

式中：E2表示各浓度多糖本身的吸光度；E1表示蒸馏水代替DPPH乙醇溶液的吸光度；E0表示蒸馏水代替多糖溶液的吸光度。

1.2.6 .3·O2

-清除能力没食子酸溶于蒸馏水配制25 mmol/L溶液；25 mL 0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液加入盐酸，调节pH值为8，定容至50 mL；以蒸馏水代替多糖溶液为空白对照，VC为阳性对照。向96孔板中依次加入180 µL缓冲液、40 µL的ACP溶液与Fe-ACP溶液混匀，37℃反应10 min；加20µL的没食子酸溶液混匀，反应4 min，325 nm下测量吸光值。重复上述试验3次，计算·O2-清除率。

式中：A0表示蒸馏水代替样品的吸光度；A表示加入样品溶液的吸光度；AX表示多糖溶液本身的吸光度。

1.2.7 ACP和Fe-ACP对氧化损伤细胞的保护作用

1.2.7 .1 ACP、Fe-ACP对小鼠腹腔巨噬细胞的安全浓度

以VC为阳性对照，模型组和空白对照组加入等量1640培养基，空白对照组细胞正常培养。采用MTT法[17]测定两种多糖对细胞的最大安全浓度。取小鼠腹腔巨噬细胞于96孔板，加入不同浓度的多糖培养44 h；加入MTT培养4 h，570 nm波长处测量吸光值。选择吸光值不显著低于空白对照组的浓度为多糖对细胞的最大安全浓度。

1.2.7 .2测定氧化损伤细胞中SOD及MDA

按照孙嘉琪[18]的方法，采用过氧化氢刺激巨噬细胞，建立细胞氧化损伤模型，以VC为阳性对照，在细胞培养皿中培养小鼠腹腔巨噬细胞17 h，加入终浓度为12.5 mg/L的过氧化氢刺激细胞30 min，弃去上清液；PBS洗涤细胞两次，加入2 mL含有胎牛血清的1640培养基终止胰酶作用；使用移液器将剩余的贴壁细胞吹下，收集细胞液于EP管中，3 000 r/min离心10 min，弃去上清液。按照试剂盒说明书步骤测定SOD的活性以及MDA的含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 柠檬酸钠添加量对Fe-ACP含铁量的影响（见图1）

由图1可知，柠檬酸钠添加量对铁含量影响较大。随着柠檬酸钠添加量增加，铁含量迅速增加；当柠檬酸钠添加量为100 mg时，铁含量达到最大值。因此，后续试验均选择柠檬酸钠添加量为100 mg。

图1 柠檬酸钠添加量对Fe-ACP铁含量的影响Fig.1 Effect of sodium citrate addition on iron content in Fe-ACP

2.1.2 反应温度对Fe-ACP含铁量的影响（见图2）

由图2可知，反应温度在40～50℃范围内时，随着温度升高，含铁量逐渐增加；当温度为50℃时达到最大值。当温度为50～90℃时，含铁量呈先逐渐降低后逐渐增加最后趋于平稳的趋势。因此，后续试验反应温度选择50℃。

图2 反应温度对Fe-ACP铁含量的影响Fig.2 Effect of temperature on iron content in Fe-ACP

2.1.3 反应时间对Fe-ACP含铁量的影响（见图3）

图3 反应时间对Fe-ACP铁含量的影响Fig.3 Effect of reaction time on iron content in Fe-ACP

由图3可知，反应时间在1～3 h时，随着反应时间的延长，铁含量逐渐增加；当反应时间为3 h时，铁含量达到最大；当反应时间大于3 h时，铁含量显著下降。因此，后续试验反应时间均为3 h。

2.2 响应模型的建立与分析

2.2.1 回归模型的建立与数据分析（见表2、表3）

根据单因素试验的结果，以多糖的铁含量为响应值，以反应温度、柠檬酸钠添加量和反应时间作为主要变量，设计3因素3水平的铁修饰的优化试验。试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 响应面试验设计方案及结果Tab.2 Response surface experiment design and result

利用Design软件对表中数据进行多元回归拟合。由表2可知，建立的模型回归极显著（P＜0.01），该方程的一次项A、B、C表现极显著（P＜0.01），说明柠檬酸钠添加量、反应温度和反应时间均显著影响多糖与铁的结合。通过对数据进行多元拟合分析获得响应值R（铁含量，%）对自变量（A：反应温度；B：柠檬酸钠添加量；C：反应时间）的二次回归方程为：R=23.52+0.77A+6.46B-1.60C-0.014AB+0.69AC+0.056BC-2.48A2-6.89B2-3.11C2。

由表3可知，该模型的相关系数R2=0.995 1，表明自变量与响应值之间的模型关系显著。失拟项P=0.697 5＞0.05，说明未知因素对试验结果的干扰很小，可应用于分析和预测多糖铁复合物合成工艺。

表3 回归模型方差分析Tab.3 Regression model variance analysis

一次项中A、B和C均为差异显著，说明反应温度、柠檬酸钠添加量和反应时间对铁含量均有显著的影响，影响的主次顺序为：B＞C＞A，其中B和C对方程的影响极显著。

2.2.2 最佳修饰条件试验及验证

通过响应面优化设计，求得响应值R的最大预测值为24.02%，此时柠檬酸钠添加量为105.78 mg、温度55.17℃、时间2.78 h；考虑到试验的可操作性，最终确定柠檬酸钠添加量为106 mg、温度55℃、时间137 min。为验证模型的可靠性，采用上述优化条件进行多糖铁复合物的合成。在此条件下进行3次重复试验，铁含量实测平均值23.92%。预测值与实际值接近，说明该回归模型可以正确反映出反应条件与铁含量之间的关系。

2.3 不同浓度ACP与Fe-ACP的抗氧化活性

2.3.1 不 同 浓 度ACP与Fe-ACP对·OH的 清 除 能 力（见图4）

图4 不同浓度ACP与Fe-ACP对OH·的清除能力Fig.4 Scavenging ability of OH·in different content of ACP and Fe-ACP

由图4可知，多糖浓度范围在0.125～2.000 g/L内，ACP和Fe-ACP对·OH的清除作用随着浓度上升而逐渐增大，且相同浓度下Fe-ACP的效果更好，表明多糖铁修饰提高了ACP对·OH的清除能力。史秋兰等[12]研究显示，多糖铁修饰对·OH的最大清除率为60.83%，显著高于修饰前多糖的最大清除率。但也有研究显示，修饰后多糖的最大清除率低于未修饰前[19]，原因可能是由于不同来源的多糖种类和结构种类差异，导致修饰前后多糖抗氧化活性的差异。

2.3.2 不同浓度ACP与Fe-ACP对DPPH·的清除能力（见图5）

由图5可知，VC对DPPH·清除效果最佳，Fe-ACP和ACP对DPPH·均具有一定的清除作用。在多糖浓度0.125～2.000 g/L范围内，清除率随多糖浓度提高而增强，呈剂量依赖关系；与ACP相比，Fe-ACP对DPPH·清除能力更 强；当 多 糖 浓 度 为2.000 g/L时，Fe-ACP和ACP对DPPH·的清除率最高。本试验结果与张辉等[20]的结论一致，原因可能是Fe3+结合部位与多糖活性基团间的相互作用，表明Fe3+引入对DPPH·清除作用具有显著增强的效果。

2.3.3 不 同 浓 度ACP与Fe-ACP对·O2-的清除能力（见图6）

由图6可知，多糖浓度在0.125～2.000 g/L范围内，VC对·O2-的清除效果最好；相同浓度条件下，Fe-ACP的·O2-清除活性明显高于ACP；随着浓度增加，Fe-ACP对·O2-的清除作用逐渐增强，多糖浓度为2.000 g/L时，清除率最高。

本试验结果与张曼等[21]的结论一致，经与Fe3+结合后多糖抗氧化能力显著提高，表明铁修饰后多糖能够提高对·O2

-的清除能力。

综上所述，经铁修饰后，多糖体外抗氧化活性显著增加，但均低于阳性对照VC对DPPH·、·O2-、OH·的清除率。本试验结果与张曼等[21]、景永帅等[9]的结论一致，原因可能是多糖分子结构中存在游离羟基，引入Fe3+后，多糖羟基暴露增加，利于捕捉自由基，进而增强多糖的抗氧化活性[22]。

2.4 ACP与Fe-ACP对氧化损伤细胞的保护作用

2.4.1 ACP与Fe-ACP安全浓度的筛选

在两种多糖的安全浓度的交集中，最终确定两种多糖的试验浓度分别为高浓度组：15.625 mg/L、中浓度组：7.813 mg/L、低浓度组：3.906 mg/L，阳性对照VC浓度为15.625 mg/L；以不含胎牛血清的1640培养基处理模型组作为阴性对照（M组），空白组（BL组）不做任何处理，除空白组外均使用过氧化氢刺激制造细胞氧化损伤模型。

2.4.2 不同浓度ACP与Fe-ACP对细胞中SOD活性的影响（见图7）由图7可知，细胞经过氧化氢处理，SOD活性显著降低，表明细胞氧化损伤模型成功。添加不同浓度的修饰前后的多糖预处理后，细胞中SOD活性均有所恢复，Fe-ACP的多糖效果高于ACP，且以中浓度的Fe-ACP的效果最好。结果表明，Fe-ACP能够改善细胞氧化损伤。

图7 不同浓度ACP与Fe-ACP对细胞中SOD活性的影响Fig.7 Effect of polysaccharides on SOD enzyme activity of cells before and after modification at different concentrations

2.4.3 不同浓度ACP与Fe-ACP对细胞中MDA含量的影响（见图8）

图8 不同浓度修饰前后对细胞MDA含量的影响Fig.8 Effect of different concentrations on MDA content in cells before and after modification

由图8可知，模型组对比空白组MDA含量显著升高，表明细胞氧化损伤模型是成功的。与模型组相比，不同浓度的修饰前后多糖均可显著减少MDA生成，修饰后多糖比修饰前多糖效果更显著，其中高浓度的Fe-ACP降低MDA效果最好，与VC效果接近。

3 讨论

多糖与铁的复合物是以铁原子为中心结构，多糖围绕铁原子旋转形成的新物质分子[19]。在形成立体结构的反应过程中，反应时间、反应温度、柠檬酸钠添加量、pH值等因素均可影响多糖与铁结合的程度。但ACP与铁结合不仅会受到单个因素的影响，还会受到多种因素间交互影响。通过响应面法设计优化ACP的铁修饰时间，可更大程度地了解各因素间的交互影响；通过考察每个因素及各因素间相互作用的影响，可使多糖与铁结合的程度最大化。

本试验结果显示，在反应温度和时间不变的情况下，柠檬酸钠添加量大于100 mg时，铁含量逐渐减少。任广明等[23]研究发现，铁含量随着柠檬酸钠添加量的增加而提高，但当灵芝多糖与柠檬酸三钠质量比大于1.0时，铁含量逐渐下降，可能是因为灵芝多糖含有羟基、羧基等亲核能力较强的供电子基团，易与金属离子结合。在柠檬酸三钠催化作用下，供电子基团的金属离子结合位点逐渐达到饱和，饱和后再添加柠檬酸钠，铁含量逐渐降低。

本试验中，当柠檬酸钠添加量和反应时间不变，温度为50～90℃时，含铁量先逐渐降低后逐渐增加，最后趋于平稳。钟普鹏等[14]对姬松茸多糖进行铁修饰，发现反应温度在60～80℃时，含铁率随温度的升高而增大；反应温度80～100℃时，含铁率先逐渐下降后增加，可能是因为水浴温度过高，高温条件下多糖结构被破坏[24]，活性下降，无法很好地与Fe3+结合，影响了多糖铁含量。王峰等[25]等对绞股蓝多糖进行铁修饰，发现铁含量随着反应时间增长而提高，但时间超过1.5 h时，铁含量逐渐下降，其原因可能是多糖铁复合物在持续加热过程中结构发生变化，部分多糖丧失活性，多糖铁复合物发生解离，引起铁含量下降。

本试验中，柠檬酸钠添加量、反应时间、反应温度对ACP铁修饰的结果影响均为极显著。柠檬酸钠添加量105.78 mg、反应时间2.78 h、反应温度55.17℃时，ACP铁复合物中的铁含量为24.02%，经过检验实际铁含量为23.92%，与预测数值接近，试验结果可信度高。

在正常生理状况下，机体内细胞维持氧化消耗和抗氧化的动态平衡[26]；细胞受损时，细胞中的自由基会病理性增加，抗氧化酶活性随之降低，细胞加速衰老，引发各种疾病。如家畜在运输过程产生的应激反应，症状较轻表现四肢无力、抽搐、口吐白沫，严重可导致家畜死亡。本试验中，经铁修饰的ACP不仅在体外展现出优秀的抗氧化活性，对氧化损伤细胞也具有良好的保护作用。

4 结论

柠檬酸钠添加量105.78 mg、反应时间2.78 h、反应温度55.17℃时，Fe-ACP中铁含量最高，为24.02%。ACP经过铁修饰后，不仅对DPPH·、OH·、·O2-的清除能力有所提升，对氧化损伤的细胞也具有很好的恢复作用，可作为一种具有良好抗氧化效果的补铁剂予以开发。但多糖经铁修饰提升抗氧化能力的机理尚不清楚，有待进一步研究。