基于1H NMR和GC-MS技术评价不同干燥方法对酸枣仁活性成分及抗氧化活性的影响

解玉军，闫 艳 ，李 泽，裴香萍，王 瑞，杜晨晖,

（1.山西中医药大学中药与食品工程学院，山西太原 030619；2.山西大学中医药现代研究中心，山西太原 030006）

酸枣仁（Ziziphi Spinosae Semen，ZSS）来源于鼠李科植物酸枣（Mill.var.（Bunge） Hu ex H.F.Chou）的成熟种子，具有养心补肝、宁心安神功效，可用于虚烦不眠、惊悸多梦、体虚多汗、津伤口渴。酸枣仁具有改善睡眠、抗氧化、保护心血管系统、调节免疫功能等多种作用。酸枣仁含有丰富的三萜皂苷、黄酮、生物碱、脂肪酸、氨基酸、多糖等成分。酸枣仁不仅应用于中医药临床用药及中药工业中，还广泛应用于功能性食品，如酸枣仁油软胶囊、酸枣仁乳饮料等。

目前酸枣仁产地加工常采用湿法脱果肉，即新鲜酸枣通过水浸泡、水冲洗去除果肉，所制得的酸枣核经晾晒、粉碎等制备工序，最终制得酸枣仁。酸枣仁传统加工环节，极易导致水污染和黄曲霉毒素污染；并且在反复晾晒过程中，易导致酸枣仁中化学成分发生酶解等不良反应，严重影响酸枣仁质量。针对上述问题，运用工业中常规干燥方法干燥酸枣仁成为其加工过程中亟需解决的重要问题。但是干燥处理是否会影响酸枣仁药材品质，未见相关研究报道；同时选择何种干燥方式更有利于降低干燥过程对酸枣仁品质的影响，也是值得深入探讨的问题。因此，亟需评价不同干燥方法对酸枣仁品质的影响，从而为酸枣仁的干燥加工方法奠定研究基础。

目前，酸枣仁在加工过程常采用传统的晒干、阴干等干燥方法。而热风干燥（Hot air drying，HAD）、冷冻干燥（Freeze drying，FD）、真空干燥（Vacuum drying，VD）等方法在干燥效率、时间消耗和保证干燥样品质量方面均显示出一定的优势。例如，HAD干燥成本低，易于控制。FD是保存营养成分和色泽的首选干燥方法。此外VD可以在一定程度上隔绝干燥样品与氧气，通常具有更高的干燥速率，并且可以获得质量较佳的干燥样品。近年来，分析仪器的巨大进步使代谢组学技术得到迅速的发展，同时应用不同的分析技术对产品质量的评价是必不可少的。氢核磁共振技术（H nuclear magnetic resonance，H NMR）可以同时检测植物组织中初级和次级化合物，具有方法便捷、准确、重现性好，且其信号强度能够反映样本中化合物浓度及其相对含量的优点。同时，气相色谱-质谱联用技术（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）具有较高的检测灵敏度和定量准确性，通过与标准谱图库比对可实现化合物结构的快速鉴定。代谢组学已被广泛应用于考察不同干燥方法对食品、中药有效成分影响的研究中。张毅航等采用高效液相色谱技术和气相离子迁移谱技术测定并比较热风干燥和冷冻干燥对猴头菇菇盖和菇柄风味物质的影响；MFN等采用H NMR代谢组学技术考察不同干燥方法对褐藻、多囊马尾藻中代谢物的影响。目前，尚没有应用代谢组学方法考察不同干燥方法对酸枣仁中化学成分及其活性影响的系统研究。

因此，本研究整合H NMR和GC-MS技术，评价HAD、FD、VD等3种常规干燥方法对酸枣仁化学成分的影响。采用1,1-二苯基苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2′-氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐）（2,2’-azino-bis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基清除能力和铁还原抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）等实验考察不同干燥方法对酸枣仁抗氧化能力的影响。应用偏最小二乘（partial least squares，PLS）相关分析，进一步明确差异性化合物、抗氧化活性和干燥方法之间的相关性，以期阐明干燥方法对酸枣仁品质的影响，为制定合理的酸枣仁产地加工规范提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酸枣 2019年9月于山西省晋中市榆次区乌金山镇（东经 112°44'52"，北纬 37°46'2"）采集成熟酸枣果实。经山西中医药大学裴香萍副教授鉴定为鼠李科植物酸枣（Mill.var.（Bunge） Hu ex H.F.Chou）的成熟果实，样品标本（编号20190913004）保存于山西中医药大学；棕榈酸、亚油酸、油酸、硬脂酸、二十烷酸和DPPH 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；十七烷酸和-生育酚阿拉丁公司；3-（三甲基硅基）氘代丙酸钠（sodium-3-（trimethylsilyl） propionate-2,2,3,3-d4，TSP） 青岛腾龙微波科技有限公司；ABTS、2,4,6-三（2-吡啶基）三嗪（2,4,6-tri（2-pyridyl）-1,3,5-triazine，TPTZ）Solarbio科技有限公司；氘代甲醇（99.8%） 德国达姆施塔特公司；重水（DO） Sigma-Aldrich公司；硅烷化试剂（双（三甲基硅基）三氟乙酰胺+1%三甲基氯硅烷） REGIS Technologies公司；正己烷（色谱纯） 天津市大茂化学试剂厂；其他化学品和试剂均为分析纯。

LGJ-10C型冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司；BGZ-76型电热鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DZF-6050型真空干燥箱上海一恒科学仪器有限公司；UV-6100S紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；DL-5-B低速离心机 上海安亭科学仪器厂；IKA A11研磨机 艾卡（广州）仪器设备有限公司；FA3204B电子天平上海精科天美科学仪器有限公司；600.13 MHz AVANCE III NMR Spectrometer 德国布鲁克公司；Agilent 7890B-5977B型GC-MS联用仪 美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 将新鲜酸枣脱去果肉，用水快速冲洗除去果核上残留的果肉，晾干表面水分备用。测定未干燥酸枣仁的初始含水量为21.03%。所有的酸枣核样品均保存在4 ℃条件下。参考本团队前期工作内容，分别称取24份酸枣核，每份70 g均匀放入搪瓷托盘中，按以下方法处理。热风干燥（HAD）：使用鼓风干燥箱干燥7 h，温度为60 ℃；真空干燥（VD）：使用真空干燥箱干燥5 h，温度为60 ℃，真空度为1.0 kbar；冷冻干燥（FD）：放于冷冻干燥机中干燥36 h，冻干压力为20 Pa，冷凝温度-50 ℃。每种干燥处理平行8份进行。

干燥完成后破除果核，获得酸枣仁并称量重量，将酸枣仁用研磨机粉碎后过3号筛，密封保存于4 ℃。水分含量测定参照《中国药典》四部中水分测定法第二法（烘干法）进行测定。所有样品干燥至水分含量均符合《中国药典》一部中酸枣仁项下规定≤9%。

1.2.2H NMR分析

1.2.2.1 样品及对照品溶液制备 精密称取干燥后的酸枣仁粉末约0.2 g，平行8份，参照Yan等的方法制备样品溶液，用于1DH NMR、2DH NMR测定。精密称取酸枣仁皂苷A、白桦脂酸、6′′-阿魏酰斯皮诺素、斯皮诺素对照品各5 mg，加氘代甲醇1 mL超声溶解；精密称取木兰花碱5 mg，加氘代氯仿 1 mL 超声溶解，室温下离心（13000 r/min，25 min），移取上清液700 μL于5 mm核磁管中用于H NMR测定。

1.2.2.2 分析条件 酸枣仁H NMR测定方法参考Yan等的方法。1DH NMR分析在25 ℃下于600 MHz核磁仪上进行（频率600.13 MHz），扫描次数为64，谱宽12345.7679 Hz，傅里叶变换频率0.188 Hz，脉冲间隔D1为 1 s，延迟时间为 5.0 s。采用 Noesygppr1d序列压制水峰，用氘代甲醇进行锁场，内标为TSP。2DH NMR（H-H COSY）分析在 25 ℃ 下于600 MHz核磁仪上采集，光谱宽度6602.11 Hz，采集时间0.15 s，扫描延迟1 s，扫描次数为16。

H NMR图谱采用Mest ReNova 14.0进行处理，核磁图谱经过定标、相位、基线校准后，以0.01积分段对化学位移区间0.6～9.5进行分段积分，其中4.77～5.03（残余水峰）和3.30～3.3（残余甲醇峰）不进行积分。将积分数据导入SIMCA-P 14.1软件中进行多元统计分析。采用GraphPad Prism 8.0软件对差异化合物进行相对含量分析，绘制箱图。2DH NMR数据采用MestReNova 14.0软件对样品和对照品图谱进行比对，对酸枣仁中5个次级化合物进行指认并确定归属。

1.2.3 GC-MS分析

1.2.3.1 脂肪酸衍生化 酸枣仁脂肪酸衍生化方法参考Yan等的方法，并略作修改。脂肪油用正己烷溶解并定容至5 mL，精密移取50 μL脂肪油溶液和10 μL十七烷酸内标溶液到180 μL衍生化试剂中，在 90 ℃ 下连续振摇（300 r/min）反应 90 min，结束后冷却至25 ℃，过0.22 μm微孔滤膜，用于GC-MS分析。

1.2.3.2 对照品溶液制备 分别使用正己烷为溶剂，制备7个对照品和内标十七烷酸的标准溶液。然后将7个对照品溶液和内标溶液混合制备混合对照品溶液：棕榈酸0.80 mg/mL、亚油酸1.44 mg/mL、油酸 2.85 mg/mL、硬脂酸 0.40 mg/mL、二十烷酸0.20 mg/mL、角鲨烯 1.37 mg/mL和-生育酚0.80 mg/mL。用正己烷对混合标准溶液进行适当浓度稀释，得到一系列不同浓度的混合对照品溶液。其中内标溶液浓度为1.20 mg/mL。衍生化方法采用脂肪油衍生化方法处理。所有溶液保存在4 ℃备用。

1.2.3.3 仪器和分析条件 脂肪酸测定使用Agilent 7890B气相色谱仪配备Agilent 5977B质谱仪。色谱柱为 HP-5毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯氦气（≥99.999%，中国），流速为1.0 mL/min，分流比为20:1，进样量为0.2 μL，进样口温度250 ℃。程序升温：起始温度 150 ℃，保持 1 min，然后以5 ℃/min升至 215 ℃，保持 5 min，之后以 5 ℃/min升至240 ℃，保持1 min，然后以10 ℃/min升至270 ℃保持10 min。传输线、离子源和四级杆温度分别为280、230 和 150 ℃。扫描范围 m/z 50～500，溶剂延迟3 min。采用SIM模式进行扫描。化合物通过与NIST 14数据库进行匹配，对每个化合物进行鉴定，并通过与对照品的保留时间进行比较进一步确认。使用MassHunter定量软件计算各化合物含量，每份样品平行制备8份。

1.2.4 体外抗氧化活性测定

1.2.4.1 酸枣仁70%乙醇提取液制备 准确称取0.5 g 酸枣仁粉末，用70%乙醇超声（功率为250 W）提取两次，每次30 min，3500 r/min离心15 min，取上清液用70%乙醇定容至25 mL，测定其抗氧化活性。

1.2.4.2 DPPH自由基清除率测定 DPPH自由基清除实验参考Yan等的方法。精密称定10.0 mg DPPH用无水乙醇定容至2.0 mL，使用时加无水乙醇稀释至吸光度在0.7～0.8范围内。3.0 mL稀释后的DPPH溶液分别加入1.0 mL逐级稀释的不同浓度的酸枣仁70%乙醇提取液中（1.0、1.6、2.2、2.8、3.4、4.0 mg/mL），暗处静置30 min后，在517 nm波长下以无水乙醇为空白对照，测定空白溶液吸光度（A），操作同前，测得样品溶液的吸光度（A）。DPPH自由基清除率按公式（1）计算，结果使用半数清除浓度（IC）值表示。

1.2.4.3 ABTS阳离子自由基清除率测定 ABTS阳离子自由基清除实验参考Zheng等的方法。将88 μL 140 mmol/L过硫酸钾溶液和5.0 mL 10 mmol/L ABTS储备液混合，于37 ℃条件下避光静置过夜，使用时以无水乙醇稀释至734 nm处吸光值为0.70±0.02。取4.0 mL ABTS稀释液加入1.0 mL逐级稀释的不同浓度的酸枣仁70%乙醇提取液中（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL），暗处放置7 min 后，在734 nm波长下以无水乙醇为空白对照，测定空白溶液吸光度（A），操作同前，测得样品溶液的吸光度（A）。ABTS阳离子自由基清除率按公式（2）计算，结果使用半数清除浓度（IC）值表示。

1.2.4.4 FRAP总还原能力测定 铁离子总还原能力的测定方法参考Yan等方法。将300 mmol/L醋酸盐缓冲液（pH=3.6）、20 mmol/L氯化铁、10 mmol/L TPTZ（40 mmol/L HCl溶液定容）按 10:1:1（v/v/v）比例混合，37 ℃反应10 min得FRAP工作液。精密吸取0.1 mL逐级稀释不同浓度的酸枣仁70%乙醇提取液（2.0 mL，1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mg/mL），加2.0 mL蒸馏水，3.0 mL FRAP工作液，摇匀，避光放置20 min，于596 nm处以蒸馏水为空白对照测定吸光度。结果以每克干质量酸枣仁中抗坏血酸质量表示，单位为mg V/g。

1.3 数据处理

采用SIMCA-P 14.1软件进行多变量数据分析和PLS分析。使用Graphpad Prism 6软件对不同干燥方法下的差异化合物进行箱图分析。在PLS分析中，将ABTS阳离子自由基和DPPH自由基的IC值转换为1/IC值。实验样品平行测定3次，结果以平均值±标准差表示，用SPSS Statistics 20软件进行ANOVA分析，并用Duncan's法进行多重比较，以＜0.05表示差异或相关性显著。

2 结果与分析

2.1 NMR分析结果

2.1.1 酸枣仁中化合物的NMR分析鉴定 不同干燥方法的酸枣仁1DH NMR图谱如图1所示，通过分析每个化合物的化学位移、偶合常数及峰形等信息，结合文献[10]并参照HMDB、BMRB数据库和H-H COSY二维谱图（图2）对本实验图谱进行分析鉴定，共指认出38种化合物，如表1所示。H NMR图谱大致可以分为3个区域：有机酸和氨基酸区（3.10～0.00）主要包括亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸和乙酸等。糖区（5.50～3.10）鉴定的成分包括-葡萄糖、-葡萄糖、木糖等。芳香区（9.50～5.50）鉴定的成分包括鸟嘌呤、腺嘌呤、富马酸和腺苷等。本部分主要针对H NMR图谱中峰较为明显的化合物进行分析描述。1.03（J=7.2 Hz）处的双峰鉴定为缬氨酸的非对映异构的甲基峰；在1.49（J=7.2Hz）和3.77（J=6.6 Hz）处的双峰被认为是丙氨酸的甲基峰；在1.90处的单峰为乙酸的甲基峰；3.65处的单峰为吲哚乙酸的信号峰；-葡萄糖（J=4.2 Hz）和-葡萄糖（J=8.4 Hz）信号在5.23和4.59处分别被识别。各类化合物的核磁数据见表1。

表1 酸枣仁中主要化学成分的1H NMR图谱数据归属Table 1 1H NMR assignments of the major components in ZSS

图1 不同干燥方法的酸枣仁1H NMR图谱Fig.1 1H NMR spectra of ZSS under different drying methods

图2 次级化合物化学归属Fig.2 Chemical attribution of secondary compounds

2.1.2 NMR多元统计分析 将采集的H NMR数据进行积分，导入SIMCA-P 14.1软件中进行多元统计分析。图3为由主成分1（39.2%）、主成分2（13.8%）和主成分3（9.6%）为坐标构建的主成分分析（principal component analysis，PCA）得分图。HAD样品与VD样品、FD样品经t2轴分开，而VD样品和FD样品经t1轴分开，3种干燥方法样品均具有一定的分离趋势，说明经3种干燥方式处理后酸枣仁样品所含化学成分存在一定差异。

图3 不同干燥方法的酸枣仁1H NMR PCA散点图Fig.3 1H NMR principal component scatterplot of ZSS with different drying methods

无监督的PCA分析方法不能忽略组内误差，因此，需要采用有监督的正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）确定不同干燥方法之间的化学差异成分（图4 A，D，G）。但是OPLS-DA的使用必须以PLS模型通过验证为基础，排列模型用于验证OPLSDA模型的拟合程度。排列模型中Q回归线与左边纵轴均相交于零点以下，且左边Q实验值低于右边的原始值，＜0.05（图4 B，E，H），说明模型有效，可以继续鉴定差异性化学成分。

将变量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）＞1作为筛选差异化合物的判定标准，并结合单因素方差分析（＜0.05）对差异化合物进行初步鉴定。VD和HAD两组间共有15个差异性化合物（图4 C），FD和HAD两组间共有15个差异性化合物（图4 F），VD和FD两组间共有10个差异性化合物（图4 I）。

图4 酸枣仁1H NMR多元统计分析Fig.4 1H NMR multivariate statistical analysis of ZSS

2.1.3 差异化合物相对含量分析 为了最大限度地了解不同干燥方法对酸枣仁的影响，对上述确定的初级和次级差异化合物，利用相对峰面积绘制箱图。图5显示了3种干燥方法对H NMR化合物的影响。FD样品中6种初级化合物（肌酸酐、甘氨酸、苏氨酸、吲哚乙酸、1,7-二甲基黄嘌呤和蔗糖）和4种次级化合物（酸枣仁皂苷A、白桦脂酸、木兰花碱和6-阿魏酰斯皮诺素）等相对含量显著高于HAD样品（＜0.05）。VD样品中的13个初级化合物（6个氨基酸、1个有机酸、4个生物碱和2个碳水化合物）和 3个次级化合物（白桦脂酸、木兰花碱和 6′′-阿魏酰斯皮诺素）相对含量显著高于HAD样品（＜0.05）。此外，VD干燥样品中6个氨基酸（亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，丙氨酸，-氨基丁酸，谷氨酰胺）、1 个有机酸（乙酸）、2个生物碱（甜菜碱，肉毒碱）和1个碳水化合物（-葡萄糖）相对含量高于FD样品（＜0.05）。

图5 差异化合物相对含量变化Fig.5 The change of relative content metabolites in ZSS

总体来说，在不同的干燥过程中，VD能保留更多的初级化合物（氨基酸和碳水化合物），而FD能够保留更多的次级化合物。相比之下，HAD会导致更多的初级和次级化合物的损失。

2.2 GC-MS分析结果

脂肪酸类成分是酸枣仁化学成分的重要组成部分，脂肪酸类成分含量在22.09%～31.10%之间。其中亚油酸和油酸具有镇静催眠、抗氧化和改善记忆的功能；而角鲨烯具有心血管保护和抗肿瘤作用；生育酚是一种天然的抗氧化剂，用于治疗老年痴呆和心血管疾病；棕榈酸等在非酒精性脂肪性肝病的预防治疗中发挥重要作用。而棕榈酸、亚油酸、油酸、硬脂酸、二十烷酸、角鲨烯和-生育酚等7种成分在酸枣仁中含量较高，因此本研究选取以上7种脂肪酸进行定量分析。

2.2.1 方法学考察结果 根据Cai等的方法，使用分析物对内标（Y）的响应比与分析物浓度对内标浓度（X）的响应比建立回归方程。棕榈酸、十七烷酸、油酸、亚油酸、硬脂酸、二十烷酸、角鲨烯、生育酚方法学考察结果见表2、表3。各标准曲线的相关系数（）值均大于0.9954。分别以3倍和10倍信噪比计算得到每个分析物的LOD和LOQ，LOD和LOQ 的 范 围 分 别 在 1.93～14.30 μg/mL 和 2.76～17.88 μg/mL之间，表明所用方法对酸枣仁中微量成分的检测具有较高的灵敏度（表2）。通过分析24 h中6个重复的QC样品和连续3 d的重复实验来评估日内和日间的精度。日内精度的RSD（%）范围为0.46%～1.69%，日间精度范围为 0.32%～4.40%（见表3）。样品稳定性通过测定 0、2、4、6、8、12、24 h化合物峰面积与内标峰面积的比值计算RSD。用6个独立的酸枣仁样品进行重复性考察。结果如表3所示，所测化合物在48 h内稳定性的RSD＜2.48%，重复性的RSD为2.26%～4.49%。在2.0 g的酸枣仁粉末中加入已知含量的7种对照品化合物（50%、100%、150%）。然后，使用1.2.3项下方法提取并分析样品。各化合物的回收率（%）按下式计算：（检出量-原有量）/加入量×100。平均回收率均在98.01%～105.59%之间，且RSD均≤3.60%（见表3）。

表2 酸枣仁脂肪酸回归方程、相关系数、线性范围、LOD和LOQTable 2 Regression equation, correlation coefficient, linear range, LOD and LOQ of ZSS fatty acids

表3 酸枣仁脂肪酸精密度、稳定性重复性和加样回收率Table 3 Accuracy, stability, repeatability and recovery of ZSS fatty acids

2.2.2 酸枣仁脂肪酸含量测定结果 采用上述GCMS方法测定VD、FD和HAD等3种干燥酸枣仁样品中7种脂肪酸含量，色谱图详见图6。从表4可知，与HAD相比，VD处理能显著保留酸枣仁样品中-生育酚、亚油酸和油酸的含量（＜0.05）；与FD相比，VD处理后样品中棕榈酸、亚油酸和油酸含量显著高于FD（＜0.05）。因此，本研究结果表明VD处理对饱和脂肪酸（棕榈酸、硬脂酸）和不饱和脂肪酸（油酸、亚油酸）含量的保留均优于其他干燥处理样品。

表4 不同干燥方法酸枣仁中脂肪酸含量（n=8）Table 4 Fatty acids present in ZSS based on the different drying methods (n=8)

图6 不同干燥方法酸枣仁脂肪油总离子流图（TIC）Fig.6 Total ion chromatograms (TICs) of fatty acids under different drying methods

2.3 干燥方法对酸枣仁抗氧化活性的影响

对样品抗氧化活性具有贡献作用的化合物容易受到不同干燥方法的影响，因此有必要探讨不同干燥方法对酸枣仁抗氧化活性的影响。采用ABTS阳离子自由基、DPPH自由基、FRAP等方法对不同干燥方法处理的酸枣仁样品进行抗氧化活性测定，见表5。FD和VD样品的DPPH自由基清除能力最强，其IC值分别为2.82±0.15和2.92±0.09 mg/mL。FD对ABTS阳离子自由基的清除能力较强，IC为0.86±0.02 mg/mL。FD样品的FRAP值最高（58.91±2.87 mg V/g），其次是 VD（57.37±3.76 mg V/g）。综合分析以上结果表明，FD处理的酸枣仁样品具有更高的抗氧化能力。

表5 不同干燥方法下酸枣仁抗氧化活性（n=8）Table 5 Antioxidant activity of ZSS under different drying methods (n=8)

2.4 不同干燥方法酸枣仁活性成分及抗氧化活性PLS分析

利用PLS模型表征H NMR差异化合物（VIP＞1、＜0.05）、脂肪酸、抗氧化活性和干燥方法之间的关系，由 PC1（57.6%）和 PC2（20.8%）构建 Biplot图（见图7）。值得注意的是，PC1轴将HAD样品与VD、FD样品分开，而PC2轴将VD样品与FD样品分开。此外，脯氨酸（9）、甜菜碱（21）和二十烷酸（F5）3 个化合物与HAD位于PC1轴负轴，并远离抗氧化活性，说明HAD处理对抗氧化活性具有负面影响。FD样品中含有较高含量的酸枣仁皂苷A（4）、白桦脂酸（5）、木兰花碱（15）、肌酸酐（17）、甘氨酸（23）、吲哚乙酸（25）、6′′-阿魏酰斯皮诺素（26）、1,7-二甲基黄嘌呤（28）和蔗糖（32），这些化合物与 ABTS•、DPPH•和FRAP聚在一起，表明上述化合物与抗氧化活性呈正相关。与FD相比，VD样品与6种脂肪酸、7种氨基酸和2种碳水化合物距离较近，但是距离ABTS阳离子自由基、DPPH自由基和FRAP较远，表明VD样品具有相对较弱的抗氧化活性。总体来说，不同类型化合物对抗氧化活性的贡献不同，FD样品中差异性化合物对抗氧化活性的贡献强于VD样品中差异性化合物对抗氧化活性的贡献，该结果与不同干燥方法样品抗氧化活性测定结果一致。

图7 不同干燥方法的酸枣仁成分与抗氧化活性的PLS分析Fig.7 PLS analysis between the constituents present and the antioxidant activity of ZSS under different drying methods

3 讨论与结论

本研究采用H NMR和GC-MS技术，评价3种常规干燥方法（VD、FD、HAD）对酸枣仁化学成分和抗氧化活性的影响。经H NMR技术鉴定出38种化合物，并找到22个差异化合物。通过对差异性化合物相对含量进行分析，发现FD干燥酸枣仁可以保留更高含量的次级化合物，如酸枣仁皂苷A、白桦脂酸、木兰花碱和6-阿魏酰斯皮诺素等；VD干燥酸枣仁样品中氨基酸和碳水化合物含量相对较高；而HAD干燥酸枣仁中对初级和次级化合物含量的保留较差。采用GC-MS技术对酸枣仁7种脂肪酸成分进行定量分析，结果表明VD干燥酸枣仁对脂肪酸的保留高于其他干燥方法。采用PLS相关分析分析不同干燥方法、活性成分以及抗氧化活性之间的关系，结果表明清除DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和FRAP等抗氧化活性与FD干燥酸枣仁样品中差异性化学成分具有较强的相关性，而VD干燥酸枣仁样品中差异性化学成分与抗氧化活性的相关性稍弱于FD样品。

FD是将被干燥的物料前处理后在低温下快速冻结，使其降到共晶点以下，然后在真空条件下加热，使冻结的水分子升华而逸出物料的过程。可以保护热不稳定化合物的降解，并抑制水依赖生化反应。在 FD 干燥酸枣仁样品中，酸枣仁皂苷 A、6′′-阿魏酰斯皮诺素和木兰花碱等次级化合物的相对含量较高，表明低温和真空条件干燥可以保留更多的次级化合物。Mediani等研究表明黄酮、黄酮苷等次级化合物在FD干燥样品中含量较高。同时，低温条件下可以抑制酶活性，降低皂苷类成分发生酶水解反应，并且避免了高温下皂苷成分的分解或转变。低温和无氧条件同时可以降低生物碱成分发生水解、氧化等反应。因此，FD干燥方法有利于保留中药次级化合物。而HAD以热空气为干燥介质，自然或强制地对流循环的方式与食品进行湿热交换，与此同时由于物料表面汽化的结果，使物料内部和表面之间产生水分梯度差，物料内部的水分因此以汽态或液态的形式向表面扩散。HAD处理导致酸枣仁中更多的初级和次级化合物的损失，其原因可能是高温可以使黄酮类成分发生水解、氧化和裂解等反应，导致含量降低。

VD是指在标准大气压下干燥产品。它可能有一个较高的干燥速率，因为水分可以在低温下蒸发，产品的微观结构已经膨化，以增强热和传质。真空干燥技术具有提高干燥速度和降低食材氧化程度等特点。VD干燥酸枣仁可以保留更多的氨基酸、脂肪酸和碳水化合物，这与已有研究结果一致。VD干燥样品中氨基酸含量较高，这可能归因于随着温度升高，氨基酸由结合态向自由态的转变，导致了氨基酸含量的增加。VD干燥样品中脂肪酸类成分含量较高，可能是由于VD过程中高温（60 ℃）可以使脂肪氧合酶和过氧化物酶失活，以及真空与氧气隔绝状态下脂肪酸的氧化减弱，进而降低了酸枣仁中脂肪酸成分的损失。此外加热处理（55～60 ℃）也会增加饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的含量。与VD相比HAD干燥样品中氨基酸，如亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、-氨基丁酸、谷氨酰胺、甘氨酸、苏氨酸等含量减少，这可能是由于氨基酸在热气流下发生氧化所致。

现代药理研究表明，机体的氧化应激水平与神经功能障碍以及神经退行性疾病如睡眠障碍等密切相关，睡眠的一种生理机能就是防御氧化应激。失眠会使抗氧化与氧化系统失衡，引起过度的氧化应激，因此，抗氧化物质对失眠、抑郁等疾病的改善具有积极的作用，有必要阐明酸枣仁中活性成分与抗氧化活性的关系。本研究中吲哚乙酸、蔗糖、肌酸酐、6′′-阿魏酰斯皮诺素、1,7-二甲基黄嘌呤、酸枣仁皂苷A、白桦脂酸、木兰花碱和甘氨酸等化合物与抗氧化活性呈较强正相关性，而脂肪酸、氨基酸等化合物与抗氧化活性具有较弱的正相关性。研究表明6′′-阿魏酰斯皮诺素具有一定的抗氧化活性，而酸枣仁皂苷A和白桦脂酸作为强抗氧化剂，可以提供大量的氢使抗氧化物质再生。木兰花碱和吲哚乙酸均能提供电子以发挥其抗氧化作用。脂肪酸通过双键断裂或提供氢质子表现出一定的抗氧化活性，而氨基酸可以使促氧化物质无毒，并使已被氧化的初级抗氧化剂再生以发挥其抗氧化活性。此外，蔗糖和葡萄糖也被发现具有抗氧化活性。因此，不同干燥方法可以通过影响酸枣仁中初级或次级化合物的含量，进而影响了其抗氧化活性。然而酸枣仁在干燥后抗氧化活性的变化是否影响了其改善睡眠作用，仍需要动物实验进一步验证。

综上所述，不同干燥方法对酸枣仁初级和次级化合物的含量均会产生一定程度的影响，而次级化合物含量的变化对酸枣仁干燥样品的抗氧化活性有更直接的影响，因此在酸枣仁干燥过程中应特别关注次级化合物含量的变化。本研究结果表明，FD是更适合酸枣仁的一种干燥方法，可以最大限度地保留酸枣仁中有效成分，有利于保证酸枣仁的质量，并且FD技术的工业化程度较高，未来在酸枣仁产业中有着巨大的发展潜力和广阔的市场前景。