经典方枳实薤白桂枝汤基准样品制备工艺研究

王盼，牟荣，鄢必新，王婷婷，李敏，秦思莲，徐云*

（1.吉林修正药业新药开发有限公司，吉林省中药标准化关键工程技术重点实验室，长春 130103；2.吉林省药品审评中心,长春 130000；3.修正药业集团股份有限公司，通化 134002）

随着2020年《国家药监局关于促进中药传承创新发展的的实施意见》、《古代经典名方关键信息考证原则》、《古代经典名方关键信息表（7首方剂）》的公布及2021年《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则（试行）的颁布。经典名方政策的落地，给经典名方研究指明了方向。枳实薤白桂枝汤是2018年国家中医药管理局公布的《古代经典名方目录（第一批）》的经典名方之一，在与古籍记录一致的前提下，结合现代研究手段对原方中未明确的参数进行考察，为后续颗粒剂研究提供参考依据。

枳实薤白桂枝汤，来源于汉·张仲景《金匮要略》[1]，由枳实、厚朴、薤白、桂枝、瓜蒌，共5味中药组成，主治胸阳不振、痰浊阻滞的胸痹。用于冠心病、心绞痛、肋间神经痛、非化脓性肋软骨炎等症。原书记载的煎煮工艺为枳实四枚、厚朴四两、薤白半斤、桂枝一两、瓜蒌实一枚（捣）。以水五升，先煮枳实、厚朴，取二升，去滓，内诸药，煮数沸，分三次温服。煎煮是影响复方质量的因素之一，本研究再结合实际生产应用的前提下，参考《古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则（试行）》及《医疗机构中药煎药室管理规范》以及相关文献[2-3]，选取加不加盖、浸泡时间、煎煮火候、煎煮时间、干燥方式五个因素，以柚皮苷、新橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚为指标性成分，采用综合评分法进行工艺优选，明确工艺参数，保证物质基准的稳定性。

1 仪器与材料

1.1 仪器

戴安U3000高效液相色谱仪（美国戴安）；NS105DU型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；SB25-12DT型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；SCIENTZ-30YG/A冷冻干燥机（宁波新芝冻干设备股份有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-III型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；砂锅（九阳牌）等。

1.2 材料

1.2.1 试药

厚朴酚（纯度：99.0%，批号：110729-202015）、和厚朴酚（纯度：99.8%，批号：110730-201915），柚皮苷（纯度：93.5%，批号：110722-202116）、新橙皮苷（纯度：99.4%，批号：111857-201804）均购自中国食品药品检定研究院。

1.2.2 试剂

甲醇、乙腈为色谱纯（美国天地高纯溶剂有限公司）；水为纯化水。

1.2.3 饮片

枳实（2007001湖南）、薤白（2004001江苏）、桂枝（2009001河北）、厚朴（2008002四川）、瓜蒌（2002001广西）药材购于河北新京源药业有限公司（经鉴定，符合《中国药典》2020年版规定）。

2 方法与结果

2.1 厚朴酚、和厚朴酚含量的测定

2.1.1 色谱条件

Kromasil C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；以甲醇-水溶液（75∶25）为流动相；流速为1.0mL/min；检测波长294nm；柱温35℃；进样量10μL。在上述色谱条件下，基准样品中的厚朴酚、和厚朴酚色谱峰的保留时间与对照品一致，分离度良好。详见图1。

图1 基准样品的HPLC色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of the substance reference

2.1.2 对照品溶液的制备

对照品储备液的制备：称取厚朴酚、和厚朴酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的溶液，即得。

对照品溶液的制备：将厚朴酚、和厚朴酚各取1mL置于50mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1mL含厚朴酚0.01004mg、和厚朴酚0.01008mg的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

取供试品1g，精密称定，精密加入甲醇10mL，称定重量，超声处理50min，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液即得。

2.1.4 线性关系的考察

精密吸取对照品储备液1mL，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀即得（1）；精密吸取对照品储备液1mL置于25mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀即得（2）；精密吸取（1）1mL置于5mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀即得（3）；精密吸取（1）1mL置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀即得（4）；精密吸取（2）1mL置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀即得（5）；将5个不同浓度的对照品溶液按上述色谱条件分别注入液相色谱仪，进样量均为10μl，测定峰面积。以进样质量（μg）为横坐标（X），以峰面积（A）为纵坐标（Y），以绘制标准曲线，求出回归方程和r值。回归方程为和厚朴酚：Y=29.71x+0.0276（R2=0.9999），厚朴酚：Y=27.518x+0.0006（R2=0.9999）。试验结果表明：厚朴酚在0.02008μg-0.502μg，和厚朴酚在0.02016μg～0.504μg范围内，呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度考察

取混合对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积RSD，考察仪器的精密度。结果表明：和厚朴酚峰面积RSD值为0.20%、厚朴酚峰面积RSD值为0.18%，均小于3%，说明仪器的精密度良好。

2.1.6 重复性考察

取本品共6份，制备供试品溶液，按含量测定方法项下操作，测定样品中厚朴酚、和厚朴酚含量，计算RSD值并考察重复性。结果表明：和厚朴酚含量RSD值为1.95%、厚朴酚含量RSD值为1.88%，均小于3%，方法重复性良好。

2.1.7 稳定性考察

取供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、10、12、14、18、24 h按含量测定方法项下操作，计算峰面积值RSD。结果表明：厚朴酚峰面积RSD为0.82%，和厚朴酚峰面积RSD为1.16%，均小于3%，表明供试品溶液在24h稳定。

2.1.8 加样回收率

取供试品0.5g，精密称定，共6份，分别加混合对照品溶液（厚朴酚6.16μg/mL，和厚朴酚3.02μg/mL）10mL，制备加样供试品溶液并按含量测定方法项下操作，计算平均加样回收率和RSD。结果表明：厚朴酚平均回收率为90.2%、RSD值0.77%，和厚朴酚平均回收率为92.1%、RSD值0.98%

2.2 柚皮苷、新橙皮苷含量的测定

2.2.1 色谱条件

Kromasil C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；以乙腈-水溶液（25∶75）为流动相；流速为1.0mL/min；检测波长285nm；柱温35℃；进样量：对照品10μL；供试品5μL。在上述色谱条件下，基准样品中的柚皮苷、新橙皮苷色谱峰的保留时间与对照品一致，分离度良好。详见图2。

图2 基准样品的HPLC色谱图Fig 2 HPLC chromatogram of the substance reference

2.2.2 对照品溶液的制备

称取新橙皮苷、柚皮苷对照品各适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含柚皮苷0.404mg、新橙皮苷0.437mg的溶液，即得相应对照品储备液。

分别精密量取对照品储备液各1ml至同一5ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含柚皮苷0.0808mg、新橙皮苷0.0874mg的混合溶液，即得混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

取本品约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇10ml，称定重量，超声处理20min，放冷再称定重量，加70%甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液即得。

2.2.4 线性关系的考察

分别精密称取柚皮苷、新橙皮苷对照品适量，分别加甲醇制成1ml含柚皮苷0.516mg、新橙皮苷0.432mg的对照品溶液，作为对照品溶液（1）；将对照品溶液（1）各取2ml加甲醇稀释并定容至5ml容量瓶中，摇匀，即得对照品溶液（2）；将对照品溶液（1）各取1ml加甲醇稀释并定容至5ml容量瓶中，摇匀，即得对照品溶液（3）；将对照品溶液（1）各取1ml加甲醇稀释并定容至10ml容量瓶中，摇匀，即得对照品溶液（4）；将对照品溶液（2）各取1ml加甲醇稀释并定容至10ml容量瓶中，摇匀，即得对照品溶液（5）。分别精密吸取上述对照品溶液（1）～（5）各10μl，按上述色谱条件分别注入液相色谱仪，测定峰面积。以进样量为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，求出回归方程和r值。回归方程为柚皮苷：y=28.045x+0.513，r=1；新橙皮苷：y=32.382x+0.2146，r=1。试验结果表明：柚皮苷在0.2064～5.16μg范围内，新橙皮苷在0.1728～4.32μg范围内呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度考察

取混合对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积RSD，考察仪器的精密度。结果表明：柚皮苷峰面积RSD值为0.56%、新橙皮苷峰面积RSD值为0.54%，均小于3%，说明仪器的精密度良好。

2.2.6 重复性考察

取样品适量，研细，取约0.1g，精密称定，共6份，按含量测定方法项下操作，测定样品中柚皮苷、新橙皮苷含量，计算RSD值并考察重复性。结果表明：柚皮苷含量RSD为0.13%；新橙皮苷含量RSD为0.28%，均小于3%，方法重复性良好。

2.2.7 稳定性考察

取供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、10、12、14、18、24 h按含量测定方法项下操作，计算峰面积值RSD。结果表明：柚皮苷峰面积RSD为1.24%，新橙皮苷峰面积RSD为1.28%，均小于3%，表明供试品溶液在24h稳定。

2.2.8 加样回收率

取供试品0.05g，精密称定，共6份，分别加混合对照品溶液（柚皮苷0.191mg/mL，新橙皮苷0.148mg/mL）10mL，制备加样供试品溶液并按含量测定方法项下操作，计算平均加样回收率和RSD。结果表明：柚皮苷平均回收率为101.87%、RSD值1.03%，新橙皮苷平均回收率为98.78%、RSD值0.84%

2.3 出膏率的测定

参照2020版《中国药典》浸出物测定法。精密吸取25mL，置干燥至恒重的蒸发皿中，水浴挥干，于105℃干燥至恒重，并计算出膏率。（出膏率（%）=干膏重/生药重×100%）

2.4 工艺参数的考察

2.4.1 提取工艺评价指标的建立

以新橙皮苷和柚皮苷的总量、厚朴酚和厚朴酚的总量以及出膏率为评价指标，计算综合得分（Y），通过综合评分法优选物质基准的提取工艺，其中柚皮苷与新橙皮苷总量、厚朴酚与和厚朴酚的总量为主要指标，分别赋予50%、30%的权重；在实际生产中，提取工艺的控制指标还包括出膏率，因此赋予20%的权重，得到最终评价指标[4]。公式如下：

2.4.2 加盖与不加盖煎煮考察

加盖与不加盖的煎煮时间上差异很大，煎煮时间的长短决定着工作进度及能源消耗的程度，煎煮条件详见表1。因此考察不加盖煎煮与加盖煎煮对出膏率以及新橙皮苷与柚皮苷总量、厚朴酚与和厚朴酚的总量的综合评分。结果见表2。

表1 煎煮条件Table 1 Decoction conditions

表2 加盖与不加盖的考察指标Table 2 Examination indicators of covered and uncovered

从表2可知，加盖与不加盖对综合评分影响较大，加盖煎煮的出膏率略大于不加盖煎煮，综合评分较高，因此选择加盖煎煮为最佳方式。

2.4.3 浸泡时间考察

待煎中药应根据其质地先浸泡，时间一般不少于30min，但没有上限。质地疏松的中药，如花、叶、细茎等，浸泡0.5h即可；坚硬的中药，如块根、根茎、种子、果实等，应浸泡1h；矿物、动物、介壳类的药材浸泡时间可适当延长。注意药材浸泡时间不宜过久，以防变质，尤其在夏季[5]。

枳实为果实类药材，厚朴为根皮类药材，因此，将枳实、厚朴的浸泡时间考察参数定为：不浸泡、0.5h、1h、1.5h，详见表3。通过对出膏率以及新橙皮苷与柚皮苷总量、厚朴酚与和厚朴酚的总量的综合评分优选最佳浸泡方式。结果见图3。

表3 煎煮条件Table3 Decoction conditions

图3 浸泡时间的考察指标Fig.3 Examination indicators of soaking time

从图3可知，不浸泡煎煮所制备的基准样品综合评分最高，且相比较煎煮时间最短，因此将浸泡时间参数确定为不浸泡。

2.4.4 后下药煎煮火候

煎药的火力按大小有文火、武火之分。文火就是小火，武火就是大火、旺火。武火的火焰大，力道猛烈，可以使温度急速上升，使药液很快沸腾，但也容易烧焦；而文火的火焰较小，力道比较温和，但煎煮时间过长。因此对煎药的火候进行考察，考察全程武火，武火煮煮沸后改文火，全程文火对基准样品的影响，详见表4。对出膏率以及新橙皮苷与柚皮苷总量、厚朴酚与和厚朴酚的总量的综合评分优选最佳煎煮火候。结果详见图4。

表4 煎煮条件Table 4 Decoction conditions

图4 后下药煎煮火候的考察指标Fig.4 Examination indicators of the decoction fire of the latter drug

从图4可知，后下药的煎煮火候对评分影响较为明显，其中选用武火煎煮后所得基准样品中综合评分最高，因此以武火煎煮作为最佳煎煮条件进行后续的考察。

2.4.5 后下药煎煮时间的考察

“茶圣”陆羽在《茶经》里说，烹茶有“沸”。一沸：如鱼目，微有声；二沸：缘边如涌泉连珠；三沸：腾波鼓浪。根据此说法确定药材应该是煎煮至三沸，但并未明确三沸之后的煎煮时间，在前期实验中得出武火煎煮至三沸大约需要1h，以此考察后下药的煎煮时间，详见表5。对比出膏率以及厚朴酚，和厚朴酚的含量优选最佳煎煮时间。详见图5。

表5 煎煮条件Table 5 Decoction conditions

图5 后下药煎煮时间的考察指标Fig.5 Examination indexes of decoction time of posterior lower medicine

由图5可知，后下药煎煮时间在1h时综合评分最高，在煎煮过程中发现，煎煮时间过长水分蒸发，容易使药材糊锅，这也可能是含量降低的原因；此外，“茶圣”陆羽称，三沸后再煮的水不宜饮用，因此，后下药的煎煮时间确定为1h，即煎煮至三沸即可。

2.4.6 干燥方式

现代提取物的干燥方式有很多，常用的有常压干燥与冷冻干燥。常压干燥法是应用最广泛，操作以及设备都很简单，但是需要时间久。冷冻干燥具有能够使样品保持良好的稳定性，热量消耗低等特点，但费用较高。两种干燥方式各有优缺点，因此通过对比出膏率以及厚朴酚，和厚朴酚的含量优选最佳干燥方式，煎煮条件见表6。结果见表7。

表6 煎煮条件Table 6 Decoction conditions

表7 干燥方式的考察指标Table 7 Drying method of examination of indicators

通过不同干燥方式的考察（见表7），可以看出，冷冻干燥技术在有效成分含量的保留以及干燥时间上都优于常压干燥，且常压干燥在干燥过程中如保存不当很容易造成样品变质；冷冻干燥技术在中药行业的应用已经相当成熟，因此，优选冷冻干燥技术作为基准样品的干燥方式。

综上所述，通过对工艺参数的考察，最终确定基准样品制备工艺为：取枳实9g、厚朴12g，加水1000mL，加盖煎煮，武火煮沸，文火煎至煎液体积为400mL，100目筛网过滤，煎液加入薤白24g、瓜蒌12g、桂枝3g，武火煮至3沸（1h），100目筛网过滤，得汤液约200mL，减压浓缩至100mL，冷冻干燥，即得。

2.5 工艺验证

按照优选的工艺参数将同一批药材制备成三批样品，并对出膏率、厚朴酚与和厚朴酚的总量、柚皮苷与新橙皮苷的总量进行考察。详见表8。

表8 三批样品工艺验证Table 8 Process validation of three batches of samples

从表8可以看出，三批工艺验证与前期工艺筛选时所得出的结果基本一致，因此可以确定基准样品制备工艺的稳定可行。

3 讨论

枳实薤白桂枝汤，来源于汉·张仲景《金匮要略》。根据汉代度量衡转化可知，一升等于200mL，所以可以确定加水量为1000mL，煎煮后体积为400mL；按照“十三五”规划教材《方剂学》，一斤等于50g，一两等于3g；考虑到枳实和瓜蒌个体差异较大并结合现今临床常用剂量，最终处方量可以确定为：枳实9g，厚朴12g，薤白24g，瓜蒌12g，桂枝3g。

中药复方制剂含有的化学成分比较多，而且存在成分与成分之间的相互作用，因此选择具有代表性的化学成分进行含量测定，能在一定程度上反映出中药复方制剂的内在质量[6]。枳实薤白桂枝汤主治胸痹，胸满而痛，甚或胸痛彻背，喘息咳唾，短气，气从胁下上抢心，舌苔白腻，脉沉弦或紧[7]。枳实善于降气开痞，除胸胁痰癖；厚朴气味厚而主降，温而专于散，苦而专于泄，下气除满，与枳实相伍，善能泻实满，消痰下气，为主药。配薤白辛温通阳，宽胸散结；瓜蒌涤痰散结，宽胸利膈。为治胸痹要药，共为辅药。佐以桂枝，既助薤白温通胸阳，又能温里而降冲气。厚朴酚及和厚朴酚是厚朴中的主要有效成分[8]，临床上常用于消除胸腹满闷，镇静中枢神经等[9]，也是2020版《中国药典》中设定的指标成分[10]；黄酮类化合物是枳实药材的主要有效成分之一[11]，其中含量较高的为柚皮苷及新橙皮苷，这两种成分具有治疗胃肠道疾病[12]、抗炎[13]和治疗癌症[14]等作用，因此本文选择厚朴酚及和厚朴酚，柚皮苷及新橙皮苷作为评价基准样品的工艺参数的指标。

本文采用单因素分析对浸泡时间，煎煮火候、时间等参数进行优选，得到最佳工艺。该工艺稳定可行，对提高枳实薤白桂枝汤的质量与临床应用具有一定参考价值。

经典名方在我国历史悠久，经典名方基准样品的研究不仅是经典名方开发的关键，也是核心内容[15]。本文依据古籍记载，对枳实薤白桂枝汤基准样品制备工艺进行研究，将其转化成现代化的提取工艺，以保证基准样品的均一、稳定，利于产品的质量评价。