HPLC法检测黑三七中20种单体皂苷含量

2022-10-26李蕾谢丽娟初赛君董亚南娄子恒曹志强徐芳菲

人参研究 2022年5期

李蕾，谢丽娟，初赛君，董亚南，娄子恒，曹志强，徐芳菲

(吉林人参研究院·吉林通化·134002)

三七为五加科多年生草本植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根[1]，是一种珍贵的中药，泛用于治疗心脑血管疾病[2-4]。始载于《本草纲目》，在我国已有400多年的栽培历史，主产于云南、广西等地[5,6]。三七味甘，微苦，温，归肝、胃、大肠经，其根、茎、叶、花均可入药。皂苷类化合物是三七的主要化学成分，也是三七中公认的主要有效成分之一。迄今为止，已从三七中分离提取鉴定了120种皂苷类化合物，而且不断有新的化合物被发现[7]。三七中的皂苷类成分均为达玛烷型四环三萜，未发现含有齐墩果酸型皂苷。从苷元角度分类，三七中的皂苷可分为20(S)-原人参二醇型皂苷（如人参皂苷Rg1、Rg2、Rh1(S)、Rh1(R)、RK3、R2等）和20(S)-原人参三醇型皂苷（如人参皂苷Rb1、Rd、Rg3(S)、Rg3(R)、RK1、Rg5等）；从皂苷角度分类，三七中皂苷大致可分为人参皂苷、三七皂苷和七叶胆皂苷等，它们通常被用作三七质量控制的标记。

黑三七是以三七为原料，经过蒸制、干燥加工的黑色或深棕色的产品。通过加工炮制，三七中的主要单体皂苷通过水解转化为人参皂苷Rg3、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rg5、人参皂苷Rh1、三七皂苷R2等稀有人参皂苷[8,9]，药理研究表明以上稀有皂苷具有更强的抗肿瘤、抗炎、提高免疫力、益智、保护心血管等药理作用，药用价值及产品附加值大幅度提升，具有很好的开发前景[10-12]。本文建立了HPLC法测定黑三七中20种单体皂苷的含量的方法，比较干三七在加工炮制过程中，随着蒸制时间的变化，黑三七中单体皂苷含量的变化，为更好的研究黑三七提供了理论依据。

1 仪器和材料

1.1 仪器

1.2 材料

三七；三七皂苷R1、R2(R)，人参皂苷Rg1、Re、Rh1(S)、Rh1(R)、Rg2(S)、Rg2(R)、Rg5、Rh2(S)、Rh2(R)、PPD、Rb1、Rd、RK3、PPT、Rg3(S)、Rg3(R)、RK1、RK2标准品均购自中国食品药品检定研究院；色谱乙腈购自Fisher；分析甲醇和正丁醇购自北京化工厂；水为超纯水。

2 方法

2.1 对照品溶液制备

精密称取三七皂苷R1、R2(R)，人参皂苷Rg1、Re、Rh1(S)、Rh1(R)、Rg2(S)、Rg2(R)、Rg5、Rh2(S)、Rh2(R)、PPD、Rb1、Rd、RK3、PPT、Rg3(S)、Rg3(R)、RK1、RK2适量，制成对照品浓度分别为0.2460、0.2830、0.2530、0.3120、0.2590、0.2730、0.2980、0.2820、0.5050、0.1960、0.1750、0.2230、0.2770、0.2610、0.2200、0.2640、0.2510、0.2080、0.2450、0.2180mg/mL的对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备

以干三七为样品，进行加工炮制。蒸制温度为98～100℃，蒸制时间每5h为一个试验点，设置22个试验点，最终得到22个黑三七样品，分别命名为G1～G21。分别取黑三七粉末2.00g，加50mL（25倍量）75%乙醇加热回流3h，重复提取2次，合并滤液，蒸干。残渣加40mL水溶解并转移置分液漏斗中，再加40mL正丁醇萃取，重复萃取5次，合并正丁醇萃取液，蒸干。残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即为单体皂苷检测样品。

2.3 色谱条件

检测单体皂苷色谱条件条件1 R1、Rg1、Re、R2(R)、Rh1(S)、Rg2(S)、Rh1(R)、Rg2(R)0～30min（19% A），30～35min（19%A～22%A），35～170min（22%A），170～175min（22%A～90%A），175～200min（90%A）流动相：乙腈-水（A-B）、波长：203nm、流速：1.0mL/min、柱温：40℃0～55min（27.5%A），55～70min（27.5%A～37%A），70～100min（37%A），100～120min（37%A～44%A），120～125min（44%A～60%A），125～155min（60%A），155～160min（60%A～90%A），160～185min（90%A）流动相：乙腈-水（A-B）、波长：203nm、流速：1.0mL/min、柱温：30℃条件3 Rg5、Rh2(S)、Rh2(R)、PPD 0～35min（51%A），35～45min（51%A～70%A），45～60min（70%A），60～65min（70%A～90%A），65～条件2 Rb1、RK3、Rd、PPT、Rg3(S)、Rg3(R)、RK1、R 90min（90%A）流动相：乙腈-水（A-B）、波长：203nm、流速：1.0mL/min、柱温：40℃

3 结果

精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，按“2.3”项下的色谱条件进行检测。供试品色谱中，再与色谱峰相应的位置上，显示出保留时间相同的色谱峰。不同蒸制时间制得的黑三七中单体皂苷含量见表1。

表1 黑三七单体皂苷含量

4 讨论

4.1 通过比较黑三七中二醇型皂苷含量可知，皂苷成分发生水解反应，人参皂苷Rb1、Rd含量逐渐变少，人参皂苷Rg3(S)、Rg3(R)、RK1、Rg5含量明显增加，G1～G10中单体皂苷含量呈逐步增加的状态，G11～G18增加幅度不明显，G19～G21含量较高。干三七制黑三七中含量最高的是G21，人参皂苷RK1为主要成分，最高可达23mg/g，详见表2。

表2 干三七制黑三七二醇型稀有皂苷含量变化

4.2 通过比较黑三七中三醇型皂苷含量可知，皂苷成分发生水解反应，人参皂苷Rg1、Re、三七皂苷R1含量逐渐变少。人参皂苷Rh1(S)、Rh1(R)、RK3、R2(R)含量明显增加，G1～G7中单体皂苷含量呈逐步增加的状态，G8～G21增加幅度不明显，G19～G21含量较高。干三七制黑三七中含量最高的是G20，三七皂苷R1、R2为三七的特征成分，三七中仅含有R1，不含R2，经加工制得的黑三七中R1转化成R2，R2含量可达4.5 mg/g，详见表3。