HPLC法测定紫菀根、茎、花中紫菀酮含量研究

张立秋，张增江，王秀春，杨帆，薛长松*

（1.通化师范学院，通化 134002；2.通化市园艺研究所，通化 134002；3.通化县水洞林业有限公司，通化 134002）

紫菀为菊科多年生草本植物，又名青菀、“小辫子”、还魂草[1,2]。主要产于黑龙江、吉林、辽宁、甘肃、山西、陕西等地[3,4]。紫菀中含有山柰酚、紫菀酮、槲皮素、异鼠李素和绿原酸等成分，具有很高的药用价值，其中紫菀酮，有止咳、平喘、润肺、祛痰、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、消炎等方面的功效[5,6]。近些年来，紫菀酮成分得到了广泛的开发利用，谢文娟[7]等研究紫菀酮对去泛素化酶2活性的抑制作用。林红[8]等研究的小儿止咳平喘口服液也有紫菀酮的参与。王芳[9]等的研究表明紫菀酮会抑制脂多糖诱导的一种巨噬细胞炎性细胞的几种因子的释放，具有体外抗炎作用。紫菀酮的最新研究中，鲜恩英[10]等研究表明紫菀酮对宫颈癌HeLa细胞的生长有明显的抑制作用。

目前对紫菀中紫菀酮的提取方法的研究主要有，程存归[11]等研究的微波辅助加压溶剂提取研究；莫尚志[12]等研究了超临界CO2萃取法；毛秋兰[13]研究了乙醇回流提取。根据实际条件考虑，由于紫菀酮无紫外吸收，早期采用薄层扫描法检测，但薄层扫描法系统误差较大[14]。国内对于紫菀酮成分的检测，现多使用高效液相色谱法[15-18]。国内其他同领域的研究中，有将紫菀植株分为根、根状茎、芦头、叶片、叶柄来检测紫菀酮含量。夏成凯[19]等将紫菀植株分为根、母根、根茎分别检测。国外的相关研究中，把紫菀进行粗制、醋制、蜜制和蒸制来研究其中的多种成分含量变化[20]。目前未查到将紫菀植株按照根、茎、花进行紫菀酮含量测定研究的。本试验参照2020版中国药典的甲醇超声提取方法[21]，采用高效液相色谱法（HPLC）将紫菀植株分为根、茎、花三部分进行紫菀酮含量检测，为更好地利用紫菀中紫菀酮成分，提高药材对于紫菀酮的利用率提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料、仪器和试剂

1.1.1 材料

紫菀（采自长白山区通化师范学院周边，经通化师范学院医药学院于俊林教授鉴定为菊科紫菀属多年生草本植物）。

1.1.2 仪器

试验所涉及的仪器设备，详见表1。

表1中电子天平：感量0.01mg和感量0.1mg两种；移液枪：选择规格为1-10μL/100-1000μL/20-200μL三种；超声机：选择功率为250W，频率40kHz的规格。

1.1.3 试剂

试验研究所涉及的试剂，详见表2。

表2 试验所用试剂清单

其中乙腈必须为色谱纯级别；紫菀酮标准品的标号为B21703-20mg。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的前处理

紫菀全植株采集后，进行清洗，分开根、茎、花三个部位，晾干，经中药粉碎机粉碎，过三号筛，将粉末密封好备用。

1.2.2 色谱条件

本试验参照2020版《中国药典》中测紫菀中紫菀酮的方法，详见表3[21]。

表3 色谱条件

1.2.3 标准品溶液的制备

将紫菀酮标准品精密称定约10mg置于10mL容量瓶中，加入少量乙腈使标准品溶解，再用乙腈定容至刻度，摇匀，配制成约1mg/mL的紫菀酮标准品溶液，备用。精密吸取标准品溶液，用乙腈分别稀释成0.1、0.5、1、5、10、100、550μg/mL的浓度梯度，分别过0.45μm的滤膜，待测，临用时现稀释。

1.2.4 样品溶液的制备

参照2020年《中国药典》一部中紫菀提取方法[21]，分别将制备好的根、茎、花的样品用十万分之一天平精密称取各约3g，分别置于具塞锥形瓶中，各精密加入甲醇20mL，分别称定重量，放入40℃恒温温浸1小时，再超声处理（功率250W，频率40kHz)15分钟，取出，冷却至室温，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液过0.45μm滤膜即得。

2 结果与分析

2.1 重复性试验

紫菀酮100μg/mL标准品溶液精密吸取20μL进行测定，同一色谱条件下连续进样6次，计算色谱峰面积相对标准偏差RSD%值，结果见表4。

表4 重复性试验结果

由表4得出，6次平行测定色谱峰面积相对标准偏差RSD=0.53%，表明仪器系统重复性较好，满足检测需要。

2.2 线性关系考察

按照1.2.2中色谱条件进行测定，将不同浓度标紫菀酮准品溶液分别吸取20μL进行测定，以标准品浓度作横坐标（x轴），以色峰面积作纵坐标（y轴），绘制标准曲线，结果如图1所示。

图1 紫菀酮标准曲线图

由图1可知，不同浓度紫菀酮标准品测得结果，线性回归方程为y=24584.32x-9013.67，相关系数R2=0.9999，结果表明紫菀酮在0.1～550μg/mL范围内线性关系良好。

2.3 定性分析试验

将流动相，标准品，跟、茎、花样品溶液分别按照上述色谱条件进行检测，根据紫菀酮标准品溶液保留时间判断根、茎、花样品中是否检测出紫菀酮成分，结果见图2。

图2 紫菀标准品与流动相的色谱图

由图2可得，紫菀酮标准品保留时间为30.620min，15min前后的色谱峰是流动相本身所具有的，根部保留时间为30.276min，茎部保留时间为30.325min，花部保留时间为30.611min。理论塔板数均达到15000以上。所以判定紫菀根、茎、花中均检出紫菀酮成分。

2.4 稳定性试验

选择紫菀根部样品溶液，精密吸取20μL，分别于提取后0、4、8、16、24、30h进行测定，根据不同时间色谱峰面积计算相对标准偏差RSD%值，结果见表5。

表5 样品溶液稳定性试验结果

由表5可知，不同时间测得紫菀酮色谱峰面积相对标准偏差RSD=0.56%，表明样品溶液在30h内较稳定，满足检测需要。

2.5 样品中紫菀酮含量测定

将紫菀根、茎、花的样品溶液进行检测，测定结果带入标准曲线，根据样品质量计算紫菀酮含量，结果见表6。

表6 单位样品紫菀酮含量

由表6可知，紫菀根部紫菀酮含量为1372.85μg/g，茎部为14.94μg/g，花中为16.42μg/g，结果表明，紫菀根中紫菀酮含量较多，茎和花中相对较少。

2.6 精密度试验

取紫菀酮根部样品5份，按照上述方法进行提取，相同色谱条件进样20μL进行平行试验，将检测结果带入标准曲线，根据样品质量分别计算每份样品测定结果，计算相对标准偏差，结果见表7。

表7 精密度试验结果

由表7可知，5次平行试验测得紫菀酮含量结果相对标准偏差RSD=1.46%，表明试验的精密度良好。

2.7 检出限试验

将紫菀酮标准品逐级稀释成不同浓度进行检测，信号和噪声的比值大于10时，确定紫菀酮的检出限。结果确定紫菀酮的检出限为0.03μg/mL。

2.8 加标回收率试验

精密称取样品约3g，共取5份，分别加入0.5mg/mL紫菀酮标准品溶液1mL，按照1.2.4中的方法制成样品品溶液，按1.2.2中色谱条件进样，记录峰面积，结果带入标准曲线，根据质量计算含量，再计算平均回收率，结果见表8。

表8 加标回收率结果

标准品平均回收率为101.02%，RSD值为0.70%。表明试验回收率非常好，满足测定需要。

3 结论

本课题采用高效液相色谱法测定长白山地区紫菀中根、茎、花中紫菀酮含量，方法提取快、灵活简便、重复性良好、检出限低、精密度良好、样品溶液比较稳定、理论塔板数达到了15000以上。测得紫菀中各部位紫菀酮含量，根部为1372.85μg/g，茎部为14.94μg/g，花中为16.42μg/g。研究结果表明，紫菀酮大量集中在紫菀的根部，茎和花中含量较少，建议利用紫菀中紫菀酮成分时，使用根部提取较为高效。此研究结果可为紫菀中紫菀酮的研究与应用提供一定参考。