3株降解玉米赤霉烯酮芽孢杆菌的快速鉴定

2022-10-26刘晓萌张云鹏邹球龙姜德铭张晓琳

中国粮油学报 2022年9期

刘晓萌，张云鹏，仉磊，印铁，邹球龙，姜德铭，张晓琳

(北京市畜产品质量安全源头控制工程技术研究中心，中粮营养健康研究院有限公司，北京 102209)

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)是一种由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)、三线镰刀菌(Fusariumtricinctum)、克鲁克维尔镰刀菌(Fusariumcrookwellense)、木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)等真菌产生的非甾体雌激素类真菌毒素，广泛污染玉米、小麦、高粱等谷物及其加工副产品[1,2]。ZEN能够通过污染的农产品及饲料进入食物链，引起畜禽动物雌激素综合症，影响动物的繁殖性能，引发人体器官病变及癌变[3,4]。ZEN污染不仅造成巨大经济损失，更严重威胁国民健康,因此亟需寻找安全、高效的ZEN降解方法,筛选高效降解ZEN的微生物成为国内外研究热点。

芽孢杆菌(Bacillusspp.)是一类革兰氏阳性菌，能够产生芽孢、抗逆性强、耐贮存，而且发酵后可产生多种酶类及抗菌化合物，被广泛应用于农业[5]、饲料[6]和发酵工业[7]中。近年来，利用芽孢杆菌进行ZEN降解的研究也逐渐增加[8-11]。但在芽孢杆菌筛选及鉴定过程中，由于芽孢杆菌的不同种群在菌落、菌体形态及生理生化特征上有较多相同之处，难以通过表型特征准确区分；而且素有“细菌化石”之称的16SrDNA基因高度保守，序列间的相似度太高，无法有效区分芽孢杆菌属内的近缘物种[12,13]。近年来，研究发现以分子进化速率更大的管家基因作为系统发育鉴定标记可以弥补16SrDNA基因的缺陷，如编码细菌DNA促旋酶基因：gyrA基因、gyrB基因[14-18]。

本研究对实验室筛选的3株降解ZEN的芽孢杆菌(Bacillussp. YW、Bacillussp. GJ、Bacillussp. CP)进行鉴定，除开展生理生化鉴定外，还利用16SrDNA、gyrA基因构建的系统发育树分析，结合贝莱斯芽孢杆菌特异引物对菌株开展进一步鉴定，为ZEN降解菌株的快速筛选及分类鉴定提供一种有效方法。

1 材料与方法

1.1 菌株

本实验室筛选的能够降解ZEN的3株芽孢杆菌，编号分别为YW、GJ、CP。

1.2 培养基

LB培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，水 1 L，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌30 min；营养琼脂(Nutrition Agar，NA)培养基。

1.3 主要试剂

胰蛋白胨、酵母提取物，DNA Marker(RTM418-02)、Pfu PCR Master Mix(KP201)、pMD19-T Vector，革兰氏染色液试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)、凝胶DNA小量回收试剂盒(D2111)，ZEN标准品、色谱纯乙腈、色谱纯甲醇，氨苄抗生素，过滤除菌。

1.4 仪器设备

Mastercycler PCR扩增仪，小型离心机，Eporator电转化仪，LC-20高效液相色谱仪。

1.5 方法

1.5.1 菌株形态学观察

取100 μL甘油保菌管中的菌液，涂布于LB平板上进行活化，置于37 ℃培养箱培养过夜，然后用无菌牙签挑取单菌落在NA平板上进行划线，置于37 ℃培养箱培养24 h，观察各个菌株的菌落形态。对37 ℃培养72 h的菌株进行革兰氏染色，光学显微镜下观察菌体的形态和大小及芽孢形成位置，拍照记录。

1.5.2 菌株生理生化特性测定

对菌株的生长温度、生长pH、氧的需求、耐盐性、过氧化氢酶、酪素水解等生理生化特性进行了测定。

1.5.3 细菌基因组DNA提取

基因组DNA使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取。

1.5.4 16SrDNA基因、gyrA基因和贝莱斯芽孢杆菌及解淀粉芽孢杆菌特异片段扩增

引物序列：采用通用引物对27F(5’-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3’)和1492R(5’-CGG(CT)TACCTTGTTACGACTT-3’)对16SrDNA基因进行扩增，采用引物对gyrA-F(5’-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3’)和gyrA-R(5’-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3’)对gyrA基因进行扩增，贝莱斯芽孢杆菌特异性引物为：Bvel-F(5’-CCTTTGCGTTTTGTTACCC-3’)和Bvel-R(5’-CACATCAATTCCTTCTCC-3’)，解淀粉芽孢杆菌特异引物为：Bamy-F(5’-CGTACACCGGCTTCAGAATAC-3’)和Bamy-F(5’-CTTCGCCTCTTGTGGCTTTA-3’)。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸4 min，35个循环，72 ℃ 10 min。PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，然后对目的DNA片段进行胶回收，与T载体连接，筛选阳性克隆子，将验证正确的质粒进行测序，将测序结果通过NCBI数据库BLAST在线比对。

1.5.5 系统进化分析

选择和各个菌株的基因序列相似性较高的菌株序列为参考序列，利用MEGA 5.1软件进行多序列比对，采用邻比法构建系统进化树，自展值为1 000次计算遗传距离(进化树展示自展值>50%的数值)。

1.5.6 ZEN降解率的检测

将培养至稳定期的菌液，6 500 r/min室温离心5 min，弃上清，将菌体沉淀用50 mol/L Tris-HCl (pH 6.90)缓冲液洗涤2次，然后重悬菌体，将细胞密度调为一致，OD600 nm吸光值为2.0，加入ZEN使其终浓度为10 mg/L，37 ℃，230 r/min振荡孵育，每隔1 h取样，加入等体积的甲醇，涡旋混匀30 s，超声波处理5 min，充分抽提。然后于12 000 r/min条件下离心10 min，取其上清液进行HPLC检测。

检测条件：安捷伦Eclipse XDB-C18柱(5.0 μm，150 mm×4.6 mm)；流动相，乙腈∶水∶甲醇=46∶46∶8；进样体积，10 μL；流速，1.0 mL/min；检测波长，激发波长274 nm，发射波长440 nm；ZEN标准曲线方程为y=779 45x-345 90，R2=0.999 9，x为ZEN质量浓度(mg/L),y为峰面积(mv·s)，标准曲线在0.5～20.0 mg/L浓度范围内线性关系良好。

ZEN降解率=(对照组ZEN含量-实验组ZEN含量)/对照组ZEN含量×100%。

2 结果与分析

2.1 形态学观察

3株菌的单细胞形态均呈杆状、芽孢尖端生长；菌株YW和CP的菌落形态非常相似，菌落呈乳白色、圆形、边缘不整齐、表面湿润凸起，菌株GJ菌落呈乳黄色、圆形、边缘不整齐、表面粗糙不透明。

2.2 菌株生理生化特性

各项生理生化指标的测定参照《常见细菌系统鉴定手册》和《微生物学实验》进行。其生理生化特性见表1所示。

表1 菌株YW、GJ、CP的生理生化特征

2.3 基于16S rDNA基因PCR扩增及系统发育分析

PCR获得16SrDNA基因大小为1 509 bp，将测序结果利用DNAMAN软件进行拼接，基因序列导入NCBI数据库，利用BLAST在线比对，结果显示YW与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)有最高同源性(99.73%)，与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、花域芽孢杆菌(Bacillusvallismortis)同源性较高(99.60%)；菌株CP与贝莱斯芽孢杆菌有最高同源性(99.73%)，其次与枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌有较高同源性(99.50%)；菌株GJ与贝莱斯芽孢杆菌有最高同源性(99.67%)，与枯草芽孢杆菌、花域芽孢杆菌同源性也较高(>99.60%)。从GenBank中选出与目标菌株同源性较高的16株菌株的16SrDNA序列构建系统发育进化树(图1)。结果显示，菌株CP、YW和GJ与贝莱斯芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)、解淀粉芽孢杆菌聚为一个小簇，但是分支的自展值较低，无法准确定位3株菌的族群。

图1 16S rDNA基因序列的系统发育树

2.4 基于gyrA基因PCR扩增及系统发育分析

PCR获得gyrA基因大小为1 023 bp，将3株菌的测序结果利用DNAMAN软件进行拼接，其基因序列分别在NCBI数据库中进行BLAST比对，结果显示它们与贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的同源性较高。YW与贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌有最高同源性(99.61%)，菌株CP与解淀粉芽孢杆菌有最高同源性(99.60%)，菌株GJ与解淀粉芽孢杆菌有最高同源性(99.12%)。基于gyrA基因序列采用邻近法构建的系统发育树分析显示(图2)，贝莱斯芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌分属于3个分支，其中菌株YW和CP与贝莱斯芽孢杆菌聚为一个分支(Ⅰ)，且自展值较高；菌株GJ与解淀粉芽孢杆菌聚为一个分支(Ⅲ)。

2.5 特异性引物PCR分析

贝莱斯芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌同源性非常高，甚至之前很多贝莱斯芽孢杆菌被分类为解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌[19-21]，但是贝莱斯芽孢杆菌基因组中含有特异的参与D-葡萄糖醛酸盐代谢的基因，而枯草芽孢杆菌及解淀粉芽孢杆菌中不含此类基因[22]。Dunlap[23]选用D-葡萄糖醛酸盐代谢途径中保守的糖激酶基因，设计特异性引物，用于贝莱斯芽孢杆菌的快速鉴定。利用该特异性引物对3株菌(YW、CP、GJ)进行扩增，由图3a可见，菌株YW和CP在100～200 bp之间出现明显的特异性条带，大小约为167 bp，而菌株GJ和枯草芽孢杆菌168(阴性对照)均无条带，说明菌株YW和CP是贝莱斯芽孢杆菌。此外，根据贝莱斯芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌已公布的gyrA基因序列为靶序列，通过比对，筛选出解淀粉芽孢杆菌gyrA基因独特的保守区，设计特异性引物，用于解淀粉芽孢杆菌的快速鉴定[24]。由图3b可见，菌株GJ在100～200 bp之间出现明显的特异性条带，大小约为115 bp，而菌株YW、CP和枯草芽孢杆菌168均无条带，说明菌株GJ是解淀粉芽孢杆菌。

图2 gyrA基因序列的系统发育树

注：a为贝莱斯芽孢杆菌特异性引物扩增的结果；b为解淀粉芽孢杆菌特异性引物扩增的结果；YW为芽孢杆菌YW；CP为芽孢杆菌CP；GJ为芽孢杆菌GJ；Bs 168为枯草芽孢杆菌168；M1为1 kb plus DNA分子量标准；M2为100 bp DNA分子量标准。图3 用特异性引物对3株菌进行PCR鉴定

2.6 降解ZEN能力测定

评估菌株降解ZEN的能力。结果如图4所示，虽然菌株YW和CP菌落及细胞形态一致，经鉴定均为贝莱斯芽孢杆菌，但是降解ZEN能力不同，因而菌株YW和CP属于贝莱斯芽孢杆菌的不同菌株。

图4 菌株YW和CP对10 mg/L ZEN的降解率比较

3 讨论

芽孢杆菌种类繁多，包括：地衣芽孢杆菌(Bacilluslincheniformis)、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、花域芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)、莫哈韦芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillussonorensis)，以及枯草芽孢杆菌亚种等，近缘物种在形态、生理生化特征及16SrDNA基因序列方面均具有很高的同源性，难以进行准确区分。传统上，菌株鉴定主要通过DNA杂交同源性分析、脂肪酸组成分析、醌组成分析等方法，但是这些方法不仅操作繁琐、对设备要求高，而且需要标准菌株作为对照。近年来，研究者发现可以采用相对保守的编码蛋白的持家基因进行系统发育分析，如Rooney等[25]利用gyrA基因对枯草芽孢杆菌的不同菌株进行多样性分析，Chun等[15]利用gyrA基因分析了枯草芽孢杆菌与相近种类的进化关系，高艳侠通过构建gyrA基因序列的进化树有效区分了3个近缘物种[26]，该方法简单快速、成本低、准确度高，可以广泛应用。