植物复合精油对5种稻谷霉变优势菌株抑菌作用研究

钱丽丽, 冷雪冬, 章采东, 符丽雪, 李殿威, 韩 驰, 左 锋,3

(黑龙江八一农垦大学食品学院1，大庆 163319 ) (国家杂粮工程技术研究中心2，大庆 163319) (黑龙江省农产品加工与质量安全重点实验室3，大庆 163319)

稻谷是我国主要的粮食作物之一，储运过程中易滋生霉菌，从而引起稻谷发霉、腐烂和变色，直接或间接地导致稻谷的品质下降[1]。在储运期间能够引起稻谷品质劣变的某些霉菌，例如黄曲霉菌等，会导致稻谷结块，结块稻谷的出糙率、整精米粒率较低，且不完善粒率明显增加[2，3]。霉菌侵染稻谷后，会破坏或降低其营养价值和风味，造成细胞毒性、生殖毒性、免疫毒性、遗传毒性、肝肾毒性以及致癌、致畸、致突变等毒副作用，给人们的身体健康造成隐患[4-6]。为保证稻谷的营养品质与质量安全，须采取有效措施控制霉菌污染。

天然植物精油是一种来源于植物的天然产物，具有广谱杀菌、生物降解、安全无毒等优点[7]，在粮食储运中抑制霉变方面具有一定潜力。其物理和化学性质不稳定在常温下能挥发，可通过蒸馏法、超临界CO2法、冷压法等进行提取[8]。天然植物精油对多种真菌和细菌具有极佳的抑制作用[9-11]，抑菌活性来源于主要成分的生物活性，或主要成分和次要成分的整体协同作用[12]，在食品药品、日化用品和制药工业等方面有着广泛的应用[13]。肉桂精油和丁香精油对许多食品中的霉菌有良好的抑制作用，可延长货架期[14]；百里香精油具有抗菌作用，可以预防食品在储运过程中受到霉菌的污染；肉桂精油和丁香精油的组合可以产生一定的协同抗菌作用，这归因于一些次要成分增强了丁香酚的活性[15]；肉桂精油、百里香精油和丁香精油具有较好的抑菌作用且可能存在协同增效作用，是配制复合抑菌精油的良好原料[16，17]。

实验室前期通过对储藏稻谷菌相分析，采用传统培养法分离纯化，基于宏基因组学技术获得霉变稻谷中5种优势菌为A.sydowii、A.candidus、N.oryzae、A.versicolor和P.brocae[18]。在前期研究结果下，研究丁香精油、百里香精油和肉桂精油对霉变稻谷中5种优势霉菌的抑制作用，为植物精油在防控稻谷储运过程中霉变应用提供参考，为开发绿色环保的储藏运输防霉剂提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肉桂精油，百里香精油，丁香精油，吐温-80，噻唑蓝(MTT)，葡萄糖马铃薯培养基。供试菌种：A.sydowii、A.candidus、N.oryzae、A.versicolor和P.brocae由黑龙江八一农垦大学食品学院微生物实验室分离鉴定。

1.2 仪器与设备

Quintix 224-1CN电子天平，QP2010PLUS气质联用(GC-MS)，LDZM-40KCS-III灭菌锅。

1.3 方法

1.3.1 孢子悬浮液的准备

对实验室前期获得霉变稻谷中5种优势霉菌进行培养。向5种霉菌培养物(A.sydowii、A.candidus、N.oryzae、A.versicolor和P.brocae)中加入10 mL体积分数0.05%的无菌吐温-80水溶液。用玻璃棒轻轻刮取培养基上霉菌孢子，4层纱布过滤，移入锥形瓶中。滤液进行充分振荡，用血细胞计数器计数孢子数，稀释至浓度为1×106～3×106CFU/mL，备用。

1.3.2 菌落直径的测定

在Cakir等[19]的方法上稍作修改，采用琼脂纸片扩散法测量3种植物精油的抗菌活性。向培养皿(d=9 cm)中加入20 mL PDA培养基，直至培养基冷却凝固，吸取100 μL孢子悬浮液均匀地涂抹于培养基表面。采用无菌操作将滤纸片(d=8 mm)放置于培养基上，轻轻按压滤纸片，使其与培养基完全接触。将3 μL单方精油滴加到滤纸片上，每次进行3组平行实验。所有操作均在无菌条件下进行，并置于27 ℃培养72 h，采用十字交叉法测定抑菌圈直径，确定平均值。抑菌圈直径越大，植物精油对5种霉菌菌株的抑制效果越好；相反抑菌圈直径越小，抑制效果越差。

1.3.3 最低抑菌浓度(MIC)的测定

通过微量稀释法确定每株霉菌的MIC，根据熊李波等[20]的方法并稍作修改。通过混料设计的设计方案，将精油按比例混合(肉桂精油∶丁香精油∶百里香精油=1∶0∶0；0∶1∶0；0∶0∶1；0.5∶0.5∶0；0.5∶0∶0.5；0∶0.5∶0.5；0.667∶0.167∶0.167；0.167∶0.667∶0.167；0.167∶0.167∶0.667；0.333∶0.333∶0.333)，3种植物精油分别用0.01% tween-80稀释至100、50、25、12.5、6.25、3.125 μL/mL备用。向1.5 mL离心管中，加入770 μL 葡萄糖马铃薯液体培养基，孢子悬浮液200 μL，精油乳浊液10 μL和20 μL 0.5 mg/mL噻唑蓝(MTT)。同时以未添加精油的离心管作空白对照。将混合物涡旋1 min直至充分混合，于28 ℃避光培养24 h。培养结束后，观察离心管中MTT溶液的颜色变化。MIC对应实验组中植物精油对5种霉菌的最低抑菌浓度，置于 28 ℃培养24 h后未产生蓝色晶体。每次同时进行3组平行实验。

表1 混料设计示意表

提高植物精油对5种优势霉菌的抑制效果，通过混料设计方法研究3种植物精油的抑菌作用。混料设计示意如表1所示，对5种优势霉菌建立预测回归方程。

1.3.4 基于混料设计方法植物精油抑菌研究

研究3种植物精油的一元、二元和三元抑菌作用，采用单纯质心设计。这些因子表示混合物中3种植物精油比例，范围从0到1，不限制设计空间。图1为复合精油在混料设计中的位置。三角形的顶点(1、2、3)表示3种单方精油，3条边线(4、5、6)的中点为两种精油的混合物，中心点(7)和3个增强点(8，9、10)表示3种精油的混合物。如表1所示，每株霉菌的实验设计包含10个评估点和4组内部验证测试(11、12、13、14)。因变量(响应值)为相应复合精油对5种霉菌(A.sydowii、A.candidus、N.oryzae、A.versicolor和P.brocae)的MIC。

图1 3种植物精油混料设计概述图

1.3.5 植物精油气相色谱-质谱(GC-MS)分析

GC-MS系统为岛津GC-MS系统，配有DB-17MS毛细管柱(L=30 m，d=0.25 mm，0.25 μm)和质谱仪5973 Network MSD。将植物精油用丙酮稀释200倍，进样量为2 μL。柱温：初始温度40 ℃，保持5 min，采用3 ℃/min升温至210 ℃。载气为氦气，流速1 mL/min，通过分流模式进样，分流比为10∶1。采用电子电离方式，电离能量70 eV，离子源温度250 ℃，接口温度230 ℃。得到的EI质谱与NIST标准质谱库进行比较，分析3种植物精油的化学组成。

1.3.6 统计分析

数据分析和响应模型的建立由DX-8 MFC Application 8.0软件处理，采用SPSS17.0软件对数据进行方差分析，采用Duncan多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 3种植物精油成分GC-MS分析

由于植物精油的种类、提取部位、生长期和产地等因素影响，同一植物精油成分略有不同，抑菌效果也不同。通过GC-MS分析3种植物精油化学成分，结果如表2所示。不同植物精油所含的成分组成和含量不同，肉桂精油包含8种成分(面积>1%)，占比97.51%，主要成分为反式肉桂醛(71.59%)和邻苯二甲酸二乙酯(12.71%)；丁香精油由7种成分组成(面积>1%)，占比97.71%，主要成分为对伞花烃(11.13%)，1-石竹烯(22.95%)，丁子香酚(42.54%)和邻苯二甲酸二乙酯(13.08%)；百里香精油包含10个成分(面积>1%)，占比97.07%，主要成分为α-蒎烯(15.19%)，对伞花烃(55.73%)和百里香酚(8.2%)。3种植物精油中均检测到对伞花烃和邻苯二甲酸二乙酯，肉桂精油和丁香精油均含有丁香酚和邻苯二甲酸二丁酯，丁香精油和百里香精油均含有丁香酚和石竹烯。植物精油中某种成分，如肉桂精油中的反式肉桂醛，丁香精油中的丁香酚和百里香精油中的百里酚，具有较强的抗菌性能[21]。Li等[22]评估了来自3个物种和7个产地的肉桂精油中的成分，发现9个样品的精油中的主要化合物为反式肉桂醛(66.28%～81.97%)，而对伞花烃、丁香酚和其他物质含量较低。研究表明，l-石竹烯和丁子香酚是丁香精油的主要成分[23]；百里香精油主要成分为对伞花烃、百里酚和香芹酚，总质量分数从57.3%到62.5%不等[24]。除了这些化合物外，本研究在百里香精油中还发现了α-蒎烯，与Rasooli等[25]研究的结果一致。

表2 3种植物精油GC-MS分析结果

2.2 单一植物精油对5种优势霉菌抑制作用研究

通过抑菌圈直径大小对单一植物精油抑菌效果进行评价，判定其对霉变稻谷中5种优势霉菌的抑制作用，如图2所示。

注：不同字母表示抑菌圈大小差异显著(P<0.05)。图2 不同精油对霉菌的抑制效果评价

3种植物精油对A.candidaus，A.versicolor和A.sydowii的抑制作用强弱为肉桂精油>丁香精油>百里香精油(P<0.05)。对N.oryzae的抑制作用强弱为肉桂精油=丁香精油>百里精香油(P<0.05)。对P.brocae的抑制作用强弱丁香精油=百里香精油<肉桂精油(P<0.05)。结果表明植物精油的抑菌作用与其化学成分和霉菌的种类有关，不同种类的植物精油抑制不同霉菌的能力也各不同。谢姊欢等[26]究肉桂、山苍子、芳樟及丁香4种植物精油及复合精油对草莓致病菌的抑菌效果，由此可知复合植物精油相比于单一植物精油具有较强的抑菌效果并可减少精油用量，所以有必要对复合精油抑菌效果进行研究。

2.3 复合精油抑菌模型的建立及霉菌抑制效果

复合精油对5种优势霉菌菌株的抑制能力进行方差分析，如表3所示。所选模型与数据具有很好的拟合性。线性、二次方和特殊立方多项式拟合的模型分别代表1种、2种和3种植物精油复合对5种霉菌菌株的抑制效果。通过方差分析(ANOVA)可知，所获得的回归模型具有统计学意义。复合精油对5株霉菌的MIC均以二次方和特殊立方多项式拟合最佳模型，间接证明植物精油间存在协同增效作用。选择显著性最强的多项式建立预测模型，复合植物精油对5株霉菌的MIC值的等高线图，旨在确定精油的联合抑菌作用,即最小化MIC值。

表3 复合精油对不同菌株抑制能力的方差分析

表4 模型的响应系数及显著性水平

建立模型的响应系数及其显著性水平表，如表4所示。由响应数据可知，百里香精油的系数最大，其次是丁香精油和肉桂精油。因此，本实验进一步验证了这3种植物精油抑菌作用的强弱。肉桂精油与其他2种植物精油复合对5种霉菌具有显著的协同增效作用(P<0.05)。将丁香精油和百里香精油进行复合，则对A.candidus、N.oryzae、P.brocae和A.sydowii具有显著协同作用(P<0.05)，对A.versicolor有显著的拮抗作用(P<0.05)。对于3种植物精油之间的相互作用，所得系数显示对A.sydowii、A.candidus、A.versicolor(P<0.05)3株霉菌具有显著的协同抑制作用，而对N.oryzae和P.brocae抑制作用不显著。3种精油的复合对A.candidus，A.versicolor和A.sydowii的最佳抑制区位于三角形的中心进一步验证丁香精油、百里香精油和肉桂精油复合对5种霉菌具有协同增效作用。

2.4 基于抑菌效果的复合精油优化最佳配比研究

根据响应优化分析，复合植物精油抑菌模型对霉变稻谷中5种霉菌菌株A.candidus、N.oryzae、A.versicolor、P.brocae、A.sydowii拟合的MIC分别为0.051、0.046、0.023、0.015、0.034 μL/mL。复合精油对5个霉菌菌株拟合的MIC值均不大于(0.062 5±0.010 0) μL/mL，低于单方精油实验组浓度，复合抑制值大于90.9%。当肉桂精油、丁香精油和百里香精油的复合比例分别为55.2%∶26.9%∶17.9%时，对5株优势霉菌的抑制作用最佳。

3 结论

肉桂精油、百里香精油和丁香精油复合对抑制霉变稻谷中5种优势霉菌具有协同抑制作用。观察抑菌圈直径大小可知植物精油对5种霉菌菌株的抑制效果，对A.candidaus，A.versicolor和A.sydowii的抑制强弱为肉桂精油>丁香精油>百里香精油；对N.oryzae的抑制强弱为肉桂精油=丁香精油>百里精香油；对P.brocae的抑制强弱为丁香精油=百里香精油<肉桂精油。建立复合精油抑菌模型确定3种植物精油具有协同作用，通过响应面优化分析得到肉桂精油∶丁香精油∶百里香精油的体积比为55.2%∶26.9%∶17.9%时，对霉变稻谷中5种霉菌菌株(P.brocae、A.versicolor、A.sydowii、A.candidus和N.oryzae)的抑制作用最佳，复合抑制值大于90.9%。