类胡萝卜素降解对枸杞酒特征香气的影响

田争福， 申鹏森， 赵 璐， 张惠玲*

（1.宁夏大学 食品与葡萄酒学院，宁夏 银川 750021；2.宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室，宁夏银川 750021）

枸杞作为宁夏特色农产品，其营养价值和药理活性受到医学专家和养生专家的高度重视[1-2]。枸杞酒作为枸杞加工后主要产品之一，保健作用和营养价值深受人们青睐，这种观念促进了枸杞酒产业的快速发展。类胡萝卜素是枸杞中重要的天然色素和抗氧化物，在枸杞酒的酿造过程中由于受到光照、氧化、高温等因素的影响，导致枸杞中类胡萝卜素降解，还有大量的类胡萝卜素在枸杞渣中并未得到利用[3-5]。周广志等通过枸杞汁的前处理，利用HPLC测定了果胶酶、二氧化硫添加量及高压灭菌对枸杞酒中类胡萝卜素含量的影响[6]。王琦等通过测定枸杞酒发酵过程中类胡萝卜素降解产物，发现10余种降异戊二烯类化合物对枸杞酒香气有特殊的贡献[7]。赵璐等在氧化、光照等方法下处理枸杞，表明枸杞渣中的类胡萝卜素未得到有效利用，降异戊二烯类化合物在类胡萝卜素中获得率较低[8]。

目前，对于枸杞渣中类胡萝卜素利用方面的研究较少[9-11]。作者采用一株可降解类胡萝卜素的库特氏菌进行实验，以3种方式降解类胡萝卜素，研究类胡萝卜素降解产物对枸杞酒特征香气的影响，为进一步探索类胡萝卜素降解产物对枸杞酒的特征香气影响提供了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

库特氏菌（Kurthia sp.）GQ-16：作者所在实验室分离保藏；法国酿酒干酵母：法国Lamothe-Abiet公司产品；干枸杞果：宁夏百瑞源枸杞产业发展有限公司产品；白砂糖（食品级）：购自当地超市；β-胡萝卜素标准品（纯度＞98%）：成都曼思特生物科技有限公司产品；磷酸氢二钠、氯化钾、硫酸镁（均为分析纯）：天津化学试剂有限公司产品；降异戊二烯类化合物标准品、甲基庚烯酮、2，4-壬二烯醛、二氢-β-紫罗兰酮、二氢茉莉酮、β-紫罗兰酮、β-大马酮、α-环柠檬醛、β-环柠檬醛、藏红花酮、香叶基丙酮、柠檬烯、丙酸香叶酯、二氢猕猴桃内酯、2，2，6-三甲基环己酮、2-辛烯醛（均为色谱纯）、正构烷烃混合标准品（C8～C40）：上海Sigma-Aldrich公司产品；2-辛醇、无水乙醇：美国Sigma试剂公司产品。

1.2 仪器与设备

TGL-16M高速台式冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；岛津GCMS-QP2010气质联用仪、DB-5MS色谱柱：美国Agilent公司产品；50/30 μm聚二甲基硅烷-二乙烯基苯涂层纤维（DVB/CAR/PDMS）萃取头：美国Supelco公司产品；DF-Ⅱ数显集热式磁力搅拌器：常州爱华仪器制造有限公司产品；JYL-C051多功能料理机：九阳公司产品；PB-LO pH计：赛多利斯科学仪器有限公司产品；AL204电子天平：托利多仪器（上海）有限公司产品；LDZX-40C型自动立式电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂产品。

1.3 实验方法

1.3.1 枸杞酒酿造条件枸杞酒工艺流程如下：

干枸杞复水（干枸杞与水体积比1∶5）打浆→榨汁→过滤→果胶酶、亚硫酸→28℃发酵→过滤→陈酿→产品。

1）对照组 将干枸杞复水（干枸杞与水体积比1∶5）榨汁后，加入亚硫酸和果胶酶，添加量分别为60 mg/L和40 mg/L，用柠檬酸将pH调至3.3，接入酵母活化液于28℃培养箱中发酵，发酵完成后过滤，陈酿15 d检测相关指标，并进行感官评价。

2）库特氏菌增香组 将干枸杞复水（干枸杞与水体积比1∶5）榨汁后，加入亚硫酸和果胶酶，添加量分别为60 mg/L和40 mg/L，枸杞清汁用柠檬酸将pH调整至3.3，接入酵母活化液于28℃培养箱中发酵，枸杞渣中接入库特氏菌活化液于28℃培养箱中发酵（降解类胡萝卜素），发酵结束将二者合并后按工艺流程过滤、陈酿并检测相关指标，同时进行感官评价。

3）高压法增香组 将干枸杞复水（干枸杞与水体积比1∶5）榨汁后，加入亚硫酸和果胶酶，添加量分别为60 mg/L和40 mg/L，然后过滤，果汁用柠檬酸调整pH为3.3，接入酵母活化液于28℃培养箱中发酵，枸杞渣置于锥形瓶中，封口后于高压灭菌锅中，120℃灭菌20 min后冷却至室温，合并发酵后过滤、陈酿并检测相关指标，同时进行感官评价。

4）库特氏菌提取酶增香组 将干枸杞复水（干枸杞与水体积比1∶5）榨汁后，加入亚硫酸和果胶酶，添加量分别为60 mg/L和40 mg/L，然后过滤，枸杞清汁用柠檬酸将pH调整至3.3，将库特氏菌（Kurthia sp.）GQ-16用察氏培养基扩大培养后于4℃下10000 r/min离心10 min取上清液，冷冻干燥后的酶制剂加到发酵液共同发酵后[12]，过滤、陈酿并检测相关指标，同时进行感官评价。

1.3.2 标准品溶液的测定标准品溶液的配制参照刘建花等的方法[13]。

1.3.3 降异戊二烯类化合物的萃取取8 mL枸杞酒于顶空瓶，加入2 g NaCl调节离子浓度，添加8 μL 2-辛醇作为内标溶液，封口，40℃磁力搅拌器上平衡10 min，插入装有50/30 μm萃取头的手动进样手柄，吸附萃取40 min后，收回萃取头纤维部分再取出萃取头，插入GC-MS进样口于250℃解吸5 min，用于GC-MS分析[14-15]。

1.3.4 气相色谱质谱工作条件色谱条件：安捷伦DB-5MS色谱柱，石英毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；程序升温：初始温度40℃，保持3 min，以5℃/min的升温速度升至120℃，再以8℃/min的升温速度升至230℃，保持10 min；载气为高纯氦气（纯度＞99.999%），载气流量1 mL/min；进样口温度为250℃，溶剂延迟3 min，进样模式不分流[16-17]。

质谱条件：EI电离源，离子源温度200℃，进样口温度250℃，EI源能量70 eV，灯丝发射电流0.20 mA，检测器电压350 V。扫描范围为m/z 20～450[18]。

1.3.5 降异戊二烯类化合物的分析方法定性、定量分析：将GC-MS分析得到的各物质质谱信息与NIST.107标准谱库自动检索对比，以化合物结构特征匹配指数大于80%作为物质鉴定标准；通过C8～C40正构烷烃混标物的保留时间，计算未知化合物的保留指数（RI），结合文献以及数据库中RI对化合物进行鉴定，并通过计算待测挥发物与2-辛醇的峰面积之比求得其含量[18-19]。

香气化合物质量浓度的计算：

化合物与内标的响应因子计算：

式中：cn为化合物质量浓度，μg/mL；Sn为化合物峰面积；S1为2-辛醇峰面积；c1为2-辛醇质量浓度，μg/mL；c0为标准品质量浓度，μg/mL；S0为标准品峰面积；RF为响应因子。

1.4 数据处理与统计分析

采用Agilent Mass Hunter 7.0进行定量分析。采用SIMCA-P进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判别分析 （orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）和数据处理。

2 结果与分析

2.1 对照组发酵前后降异戊二烯类化合物对比

由图1可以看出，枸杞汁中的降异戊二烯类物质只检测到6种。在整个发酵过程中，类胡萝卜素在外界因素与各种反应下降解，在枸杞酒中检测到13种降异戊二烯类物质，枸杞酒中的降异戊二烯类化合物质量浓度整体高于枸杞汁，而其中α-环柠檬醛质量浓度低于枸杞汁中的值，这是因为α-环柠檬醛在发酵过程中一部分反应变成β-环柠檬醛的同分异构体。但同时也有部分类胡萝卜素降解生成α-环柠檬醛，因此，枸杞酒中α-环柠檬醛与β-环柠檬醛总量高于枸杞汁。

图1 对照组枸杞汁和枸杞酒中降异戊二烯类化合物种类及质量浓度Fig.1 Types and contents of isoprene compounds in wolfberry wine and wolfberry juice in the control group

2.2 不同增香工艺发酵后枸杞酒中类胡萝卜素降解规律

由表1可以看出，3种降解类胡萝卜素的方法共产生15种降异戊二烯类化合物，其中玉米黄素双棕榈酸酯变化最大。玉米黄素双棕榈酸酯中有很多双键结构[20-21]，且带有很多的甲基，双键容易被破坏发生反应，甲基极容易发生取代、氧化反应，从而发生降解。实验测定，类胡萝卜素降解生成的降异戊二烯类化合物含量较多的几种都是以双键位置断裂反应生成的。

表1 不同增香工艺枸杞酒产生降异戊二烯类化合物的规律Table 1 Producing pattern of isoprene compounds in different wolfberry wine produced by flavor-enhancing technology

续表1

枸杞酒中类胡萝卜素降解后产物最多的是香叶基丙酮，是由C7’～C8’、C13～C14断裂生成的，具有青香、果香、蜡香和木香，为枸杞酒提供了复杂的香气。最具有典型性香气的β-大马酮是由C10～C11断裂、C9去氢氧化生成，为枸杞酒提供了独特的玫瑰香。

2.3 不同增香工艺枸杞酒中降异戊二烯类化合物种类及质量浓度

由表2可以看出，采用3种工艺制作的枸杞酒中降异戊二烯类化合物的种类和质量浓度均有差异。其中，高压法增香组与库特氏菌提取酶增香组各检测到15种降异戊二烯类化合物，库特氏菌增香工艺所制枸杞酒中共检测到14种降异戊二烯类化合物，未检测到柠檬烯；3种增香工艺降异戊二烯类化合物总量差异极大。两种生物法相比较，采用库特氏菌提取酶增香工艺的枸杞酒中降异戊二烯类化合物明显高于库特氏菌增香工艺。

表2 不同增香工艺枸杞酒中降异戊二烯类化合物种类及质量浓度Table 2 Types and mass concentration of isoprene compounds in wolfberry wine produced by different flavor-enhancing technology

将库特氏菌提取后的酶制剂用于发酵过程，相对于直接采用库特氏菌发酵而言，减少了菌种增殖代谢对营养物质的消耗，可以很大程度地增强枸杞酒的香气。

相对于高压灭菌降解类胡萝卜素而言，采用库特氏菌外源酶具有条件温和的优势。枸杞酒作为一种果酒，属于热敏性物料[22-23]。经过高温高压处理后，不可避免地会产生蒸煮味。且在高温高压条件下，会导致类胡萝卜素降解产物降戊二烯类化合物进一步断裂而降解，生成相对分子质量更小却不具有香气的挥发性物质。

2.4 3种增香工艺酿造枸杞酒感官评价

在评价指导员的指导下筛选出10位接受过“食品感官评定”课程并参与训练的评价员进行感官品评。由图2可知，不同增香工艺对枸杞酒的感官品质影响较大。库特氏菌增香枸杞酒色泽、口感浓郁度略占优势，但平衡性和典型性明显不足；高压法增香枸杞酒经过高温破坏了大分子结构使其下沉，因此在澄清度上较优，但因为焦糖化反应的发生，色泽较暗；库特氏菌提取酶增香酒苦味物质略微不足，在香气浓郁度、整体口感质量和平衡性方面均更佳。因此，库特氏菌提取酶在不破坏原酒香气成分的基础上还可以增加更多降异戊二烯类化合物，提高枸杞酒品质。

图2 感官评价图Fig.2 Sensory evaluation diagram

3 结语

通过对3种酒样中降戊二烯类化合物的测定并结合感官品评，发现采用库特氏菌酶制剂辅助发酵，枸杞酒中的降异戊二烯类化合物最多，具有典型香气和浓郁口感。采用库特氏菌酶制剂辅助发酵，一方面不仅可以提高类胡萝卜素的降解率，从而产生更多的降戊二烯香气成分；另一方面，避免了库特氏菌自身的代谢活动产生其他代谢产物影响酒体的协调性；其次，使用生物酶时反应温度低，避免了因高温加热而对酒体产生不良风味。

在枸杞酒酿造过程中，可以将枸杞汁采用库特氏菌酶制剂进行降解处理，在此之前对枸杞渣可适度配合使用高压灭菌，从而改进枸杞酒的酿造工艺，提高枸杞酒香气。作者研究了不同增香工艺对枸杞酒中降异戊二烯类化合物种类及含量的影响，为探究类胡萝卜素降解产物对枸杞酒特征香气的影响提供了基础。