多价肺炎链球菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗的研究进展

田雨，马可 综述，苏晓叶 审校

北京智飞绿竹生物制药有限公司，北京 100176

肺炎链球菌是一类革兰染色阳性致病菌［1］，首次分离于1881年。肺炎链球菌表面黏液层化学成分为多糖的荚膜，是肺炎链球菌主要的致病物质，具有抗原性，根据其结构特异性可将肺炎链球菌分为90多个血清型［2］，其中，10种最常见的血清型（1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F）导致了全球62%的相关侵袭性疾病［3］。接种多价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗是预防肺炎链球菌相关疾病的有效途径，该类型疫苗的应用大幅降低了肺炎的发生。由于夹馍多糖属于T细胞非依赖性抗原，不能产生高亲和力抗体和免疫记忆，因此不适用于婴幼儿［4］。将肺炎链球菌荚膜多糖与各种蛋白物质结合可提高肺炎疫苗的免疫原性、激发产生记忆抗体并扩大其使用范围，目前，7、10及13价肺炎链球菌多糖-蛋白结合疫苗（简称肺炎结合疫苗）已相继问世，15及20价肺炎结合疫苗处于临床研发阶段。本文就肺炎结合疫苗研发、制备方法、免疫原性影响因素和国内接种情况等方面的研究进展作一综述。

1 肺炎链球菌疫苗研发

1.1 肺炎链球菌荚膜多糖疫苗 细菌荚膜多糖是人体内具有免疫原性的非蛋白物质，机体针对荚膜多糖所产生的抗体能有效防止肺炎链球菌的感染［5-6］。1945年，首次明确4价荚膜多糖（血清型1、2、5和7）具有免疫效果，随后多价肺炎链球菌多糖疫苗相继问世［7］。1946年，美国首次批准了含有6种血清型的2种肺炎链球菌疫苗；1977年，又成功注册14价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗（包括血清型1、3、4、6A、6B、7F、8、9N、12F、14、18、19F、20、23F）；1983年，23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗（包括血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和33F）批准上市，该疫苗血清型能够覆盖90%的美国耐药菌株及85%～90%的流行菌株［3］，在中国，这些血清型的覆盖率为80%。23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗是至今为止含血清型最多的上市产品，成年人免疫后，特异性抗体显著提高，但近20%的老年人对其免疫反应低下，不能诱发高亲和力抗体和免疫记忆，也不适用于2岁以下的婴幼儿。

1.2 多价肺炎结合疫苗 肺炎链球菌荚膜多糖与蛋白的共价偶联能迅速激发免疫应答及诱导产生免疫记忆抗体［8］，可用于婴幼儿，弥补了荚膜多糖疫苗的不足。2000年，由辉瑞公司研制的Prevenar成为首个上市的7价肺炎结合疫苗，由7种血清型的荚膜多糖（血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F）与白喉类毒素突变体CRM197共价结合制成，WHO评估证明，该疫苗具有较高的安全性［9］。Prevenar于2006年在英国上市，2008年在中国上市，随着该产品的推广免疫，肺炎链球菌性疾病发病率大幅下降，而非疫苗血清型肺炎链球菌感染却随之增长。为应对上述问题并提高肺炎结合疫苗的免疫性能，葛兰素史克研制的Synflorix10价肺炎结合疫苗（血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F）和辉瑞公司的Prevenar13（血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F）相继获批准上市［10］。这两种疫苗均能激发较强的免疫应答，并具有较高的安全性和耐受性，均可在婴儿体内能诱发免疫应答反应，使肺炎结合疫苗的适用范围进一步扩大。Synflorix10和Prevenar13疫苗在免疫地区的血清型覆盖率分别为70%～84%和74%～88%［11］。

1.3 多价肺炎结合疫苗的研究进展2019年12月，我国玉溪沃森生物技术公司自主研发生产的13价肺炎结合疫苗上市注册申请获批，这是我国首个自主研发生产的肺炎结合疫苗，也是全球第2个13价肺炎结合疫苗，该疫苗包含的血清型与Prevenar13疫苗的血清型相同。临床试验结果显示，2月龄～5岁婴幼儿免疫1～3针后，所有血清型的反应率均高达88%以上［12］，表明2月龄～5岁婴幼儿可接种该疫苗。默沙东公司研制的15价肺炎结合疫苗V114是在Prevenar13基础上增加了22F和33F血清型［13］，该疫苗的Ⅱ期临床试验结果显示，健康婴儿分别免疫V114和13价结合疫苗后，V114中增加的22F和33F血清型分别达到免疫标准的98%和87%，截至目前，该疫苗的Ⅲ期临床试验也已经结束［14］，并将于2020年底提交成人V114许可申请。2019年2月，辉瑞公司研发了20价肺炎链球菌结合疫苗，该疫苗除含有已上市的13价肺炎链球菌结合疫苗包含的血清型外，增加了8、10A、11A、12F、15B／C、22F和33F 7种血清型［15］，拓展了肺炎链球菌疫苗免疫预防范围，2020年5月，辉瑞公司公布了18～49岁接种该结合疫苗Ⅲ期批量研究阳性结果［16］，6月开始了两项Ⅲ期临床试验的免疫接种［17］。

2 肺炎结合疫苗的制备方法

2.1 直接结合法 直接结合法是利用肺炎链球菌荚膜多糖表面固有的官能团与蛋白载体表面的官能团进行共价偶联，多糖表面丰富的官能团为与蛋白的直接结合提供了便利。辉瑞公司13价肺炎结合疫苗使用的胺还原法是典型的直接结合法，肺炎链球菌荚膜多糖表面的邻位羟基经水解或强氧化剂（如高碘酸钠）氧化后形成末端醛基，可与蛋白表面的氨基形成席夫碱结构，在还原剂（如氰基硼氢化钠）存在下转化为较为稳定的C-N结构结合物［18］。另外，多糖表面的末端羟基也可在溴化氰或1-氰基-4-二甲基氨基吡啶翁四氟硼酸盐［1-cyano-4-（dimethylamino）pyridinium tetrafluoroborate，CDAP］活化的条件下形成氰酸酯键，该官能团可直接与蛋白表面的氨基进行共价结合形成多糖-蛋白结合物；多糖表面的羧基也可在碳二亚胺存在的情况下与载体蛋白表面的氨基共价结合。见图1。

2.2 间接结合法 间接结合法是利用链接剂将肺炎链球菌荚膜多糖与载体蛋白进行共价结合的方法，该方法可降低空间屏蔽作用，从而影响结合物的免疫原性。目前，比较常用的连接剂是己二酰肼，两端的-NH2可在碳二亚胺存在时分别与多糖上的氰酸酯基（表面羟基经溴化氰或CDAP活化后获得）和载体蛋白的羧基反应键合［19］。见图1。

2.3 其他方法 多糖与载体蛋白的共价结合可在不同官能团的基础上借助不同链接剂进行偶联。多糖表面可利用的官能团主要有-OH、-COOH和-NH2，载体蛋白表面可利用的基团主要有-COOH、-NH2、-SH、和OH等，上述官能团均可通过图1所示方法将多糖与蛋白进行共价结合。

图1 多糖-蛋白结合物制备反应示意图Fig.1 Schematic diagram of preparation reaction of poly-saccharide-protein conjugate

3 影响肺炎结合疫苗免疫原性的因素

3.1 载体蛋白 载体蛋白是影响肺炎结合疫苗免疫原性的重要因素之一。任何携带T细胞辅助表位的蛋白均可作为结合疫苗的载体蛋白，疫苗制造商常采用具有良好安全性、易于生产且低成本高产量的蛋白质。目前，较常用于肺炎结合疫苗的载体蛋白有白喉毒素无毒突变体CRM197、破伤风类毒素（tetanus toxoid，TT）、白喉类毒素（diphtheria toxoid，DT）及不可分型嗜血杆菌蛋白D，已上市的7和13价肺炎结合疫苗及默沙东公司研发的15价肺炎结合疫苗均采用白喉毒素无毒突变体CRM197为载体蛋白；Synflorix10价肺炎结合疫苗分别采用不可分型嗜血杆菌蛋白D（1、4、5、6B、7F、9V、14、23F型）、TT（18C型）及DT（19F型）作为载体蛋白；云南沃森生物技术股份有限公司的13价肺炎结合疫苗采用应用广泛、不具有致病性、耐受性良好且生产工艺成熟的TT作为载体蛋白。除上述常用载体蛋白外，已研发出更多高性能、廉价易得的载体蛋白用于肺炎结合疫苗的制备。如刘建［20］将单一位点突变而成的脱毒肺炎链球菌溶血素作为载体蛋白与肺炎荚膜多糖结合，与传统载体蛋白TT的结合物进行免疫性对比研究，结果证实，该新型载体优于传统载体TT；周觉非等［21］以改良胺化还原法将重组B群脑膜炎球菌外膜蛋白与19F型肺炎链球菌荚膜多糖结合，研究结果显示，制备的结合物免疫动物后产生了高滴度的抗19F型肺炎链球菌荚膜多糖的抗体，且具有免疫记忆。另外，牛血清白蛋白、霍乱毒素B亚单位、绿脓杆菌外毒素A、百日咳毒素、乙型肝炎病毒表面抗原、淋球菌P-3-2菌毛、大肠埃希菌热敏感肠毒素等大量可作为载体蛋白的物质也均可应用于多糖结合疫苗研究开发［22-26］。

3.2 糖链长度 肺炎链球菌多糖结合物制备过程中所使用的寡糖池一般由多糖或通过降解获得的低聚糖片段组成，这些“糖碎片”的糖链长度（寡糖或多糖）不确定且不均匀，而不同的糖链长度可能会对结合疫苗的免疫原性产生较大影响。LAFERRRIERE等［27］将5种肺炎链球菌多糖（3、6A、1SC、19F、23F）进行水解，洗脱过程中进行分级分离，并将适当的级别合并为4个平均分子量不同的组合，再制备相应的多糖-TT结合物，研究结果显示，仅19F结合物的免疫原性随着糖链长度的增加而降低。DAUM等［28］在400名美国婴儿中评估了6种不同糖基链长度制备的五价肺炎链球菌结合疫苗Pn-CRM197（6B、14、18C、19F、23F）的安全性和免疫原性，研究结果显示，Ps（原糖，未水解）结合疫苗的免疫原性明显优于Os（寡糖，Ps水解后）。张萍等［29］将1型和14型肺炎链球菌荚膜多糖用乙酸水解，生成的寡糖与原糖分别与TT结合，考察结合疫苗中糖链长度和免疫原性的相关性，结果显示，寡糖结合物与原糖结合物的免疫原性差异较小，其研究结果也证实了水解过程未破坏多糖的抗原决定簇。乔瑞洁等［30］以不同重复单位数的18C多糖片段与TT制备结合物，研究多糖片段的大小对结合物免疫原性的影响，结果显示，较短的多糖片段制备的结合物免疫原性高，其免疫血清的GMT高、调理吞噬能力强。

以上糖链长度对免疫原性影响的研究结果各有不同，产生影响的原因也尚未明确，比较研究结果推测，糖链长度对免疫原性的影响可能由于血清型及载体蛋白的不同而导致效果产生差异，其影响机制尚需深入研究。

3.3 结合方式 多糖与蛋白的结合方式主要分为直接结合和间接结合，直接结合是利用多糖和蛋白表面的官能团进行有机键合；间接结合则是利用“桥连接剂”将多糖与蛋白链接。两种结合方式可能会对肺炎结合疫苗的免疫原性产生影响，主要表现在桥连接剂既有“桥”的作用也可能具有降低屏蔽效果（庞大体积蛋白对多糖抗原表位的空间屏蔽）的作用［31］，且连接剂的性质也可能会影响肺炎结合疫苗免疫原性的表达。有报道将1型肺炎链球菌多糖分别以溴化氰活化法及胺还原法两种结合方式与TT制备结合物，并评价其结合物的免疫原性，结果显示，前者制备的结合物具有良好的抗原性和免疫原性，且具有免疫加强效应，表明溴化氰活化法制备的1型肺炎荚膜多糖结合物优于胺还原法［32］。刘爱萍等［33］则将14型肺炎多糖以TT及TTAH（己二酸二酰肼衍生的TT）为载体蛋白制备结合物，并评价两者的免疫原性，即直接结合法与ADH为桥连剂的间接结合法的对比研究，结果显示，以小鼠为免疫对象，两者均能够诱导相对于单纯多糖更高的免疫抗体，前者免疫3针，每针均有剂次加强效应，后者免疫3针后，也呈现剂次加强趋势，但前者获得的最终抗体量远高于后者，该研究结果证明14型肺炎多糖与TT直接结合能获得较高免疫原性。胡浩等［34］课题组对1型肺炎多糖表面官能团的反应活性进行了研究，结果证明，1型肺炎多糖与TT及TTAH结合物的免疫原性差异较小。两项研究均证明，即使载体蛋白和结合方式相同，对免疫原性的影响也因血清型而异。

多糖与载体蛋白的结合方式多种多样，多糖血清型、载体蛋白、结合方式三者变量，任变其一均可能导致免疫原性发生较大改变，因此，在研究新型多糖-蛋白结合方式时应更深入调查，不宜以偏概全。

3.4 其他因素 研究表明，在肺炎链球菌4型多糖蛋白结合疫苗中加入高剂量的游离糖会降低结合物的免疫原性［35］。有研究将聚乙二醇-十六烷（polyethylene glycol-hexadecane，PEG-HDA）作为佐剂［36］，并评价其免疫原性，结果显示，PEG-HDA作为佐剂时结合疫苗的抗体滴度明显高于仅以PEG作为佐剂的结合疫苗，可明显提高结合疫苗在体内的免疫原性。杨英英等［37］考察了6A型肺炎结合疫苗分子大小对免疫原性的影响，结果显示，结合物的分子大小对免疫原性无明显影响。LEE等［38］利用各种官能团对肿瘤多糖进行修饰，与白喉毒素无毒突变体CRM197结合后表现的免疫原性不同，肺炎结合疫苗也可能因修饰物或修饰位置的不同而表现出不同的免疫原性。

影响肺炎结合疫苗免疫原性的因素有许多，除了以上几个主要影响因素外，结合物疫苗溶液的离子强度大小、有无防腐剂、pH及多糖蛋白比等均可能影响结合物的免疫原性［31］，相关研究结论较少，仍需进一步探索以获得更高免疫原性的肺炎多糖结合疫苗。

4 肺炎疫苗国内接种现状

肺炎疫苗在中国属于二类疫苗，需根据公民自我意愿自费接种。国内市场可获得的肺炎疫苗有23价肺炎链球菌多糖疫苗、7价肺炎结合疫苗及13价肺炎结合疫苗。2014—2016年，河北省疾病预防控制中心收集儿童非重复性肺炎链球菌菌株，其中88.94%分离自2岁以下儿童，共检出血清型23种，在所涉及的血清型中，7价肺炎结合疫苗和13价肺炎结合疫苗的覆盖率分别为43.27%和86.06%［39］。可见13价肺炎结合疫苗有较好的覆盖率。天津市于2010—2016年对0～6岁二类疫苗接种状况调研中，7价肺炎结合疫苗接种率为3.88%，23价肺炎结合疫苗接种率为21.8%，且疫苗受种率随年龄增长依次升高，全程受种率分别为1.16%和21.80%［40］，调查说明，儿童肺炎疫苗尤其是肺炎结合疫苗的受种率尚有待提高。2018年，四川资阳市对老年人（≥60岁）的接种认知情况进行抽样调查，结果显示，肺炎疫苗接种率为7.80%，在未接种肺炎疫苗的老年人中愿意接种肺炎疫苗的仅占34.53%，对肺炎疫苗的总体正确认知率为50.52%［41］。同年，上海市进行的问卷调查结果显示，有70.75%老年人愿意接种肺炎疫苗，在不愿意接种肺炎疫苗的人群中，49.57%认为无必要接种，15.38%认为疫苗预防作用不大［42］。两项调查结果对比可知，老年人对接种肺炎疫苗的认知和意愿也因地域而异，这可能与地域文化、经济条件和／或疫苗宣传力度等有关。

5 小结

肺炎结合疫苗有效降低了侵袭性肺炎链球菌疾病的发病率，为扩大适用范围及对非疫苗血清型引起的肺炎链球菌病例的上升，继研发7价肺炎结合疫苗后，10、13及15价肺炎结合疫苗相继问世。为提高肺炎结合疫苗的免疫原性，研究者对载体蛋白种类、糖链长度和结合方式等影响免疫原性的因素进行了深入研究，影响因素会由于血清型、载体蛋白、结合方式，离子强度、pH、多糖蛋白比等导致效果不同，因此研究过程应注意限制单一变量且不宜以偏概全。肺炎疫苗可有效预防肺炎链球菌引起疾病，现有的23价多糖疫苗和13价肺炎结合疫苗既有国产也有进口产品，但以进口为主，疫苗价格较高，影响到其接种率。为提高接种率，进而形成群体免疫，在鼓励国内企业研发新型肺炎疫苗的同时，政府应加大细菌性肺炎和肺炎疫苗知识的宣传力度。