四价流感疫苗研发及应用进展

吴业红，张雪梅

长春生物制品研究所有限责任公司，吉林 长春 130012

流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，可导致全人群感染。高风险人群主要包括5岁以下儿童及婴幼儿、65岁以上老年人、医护工作者、患慢性基础疾病、自身免疫病及肿瘤等免疫低下患者等［1］。据WHO统计，每年流感可导致全球300万～500万人感染，29万～65万人死亡［2］。流感病毒为正黏病毒科成员，病毒基因组由8个分节段的单负链RNA组成。由于流感病毒缺乏校正的RNA聚合酶，易于发生突变，致使流感抗原发生漂移和转变，漂移往往造成流感的季节性流行，而转变往往导致流感大流行［3-4］。目前，接种流感疫苗仍是预防流感以及降低流感并发症的有效手段。

流感疫苗价数的演变基于对流感病毒的逐渐认识和理解。自1937年研制出第一种单价A／H1N1流感疫苗以来，流感疫苗始终需适应流感毒株流行的变化，以提供对主要流行流感病毒的保护。1940年首次分离出B型流感病毒后，开发了二价（A／H1N1，B）流感疫苗。1958年，引起全球流行的甲型流感病毒亚型发生了变化，由H2N2代替了H1N1，1968年又由H3N2代替了H2N2。1978年，在A／H1N1与A／H3N2病毒重新出现并共同流行后，WHO首次推荐了含2种甲型流感亚型病毒和1种乙型流感病毒的季节性三价流感疫苗（trivalent influenza vaccine，TIV）［5］。但自1985年以来，两种抗原性截然不同的B型流感病毒在全球流行，且自2001年以来共同流行［6］。两种谱系的B型流感病毒抗原很少诱导或无针对另一谱系的交叉保护反应，预防B型流感病毒依赖于正确预测在即将到来的季节中可能占主导地位的B系毒株。对26个国家B型流感病毒的回顾性分析显示，WHO推荐纳入的B型流感病毒抗原谱系有25%左右的季节与主要流行病毒谱系不同［7］。在不匹配的季节，流感疫苗的效果可能不理想，无法抵御B型流感流行，可能导致这些季节的公共卫生负担增加［8-10］。而四价流感疫苗（quadrivalent influenza vaccine，QIV）包含两种谱系的B型流感抗原，避免了TIV由于抗原不匹配造成的疫苗有效性下降的问题。因此，从2012年开始，已有QIV陆续在世界各地上市。目前，根据不同技术路线，可将已上市的QIV分为灭活、减毒和基因重组疫苗。本文对QIV研发及应用进展作一综述，以期为流感防控与流感疫苗研发及应用提供参考。

1 鸡胚基质灭活QIV

鸡胚基质灭活流感疫苗距今已有80多年的历史，其生产工艺成熟，已在全球范围内大规模接种，具有良好的安全性和免疫原性，为市场的主流产品。当前鸡胚四价流感疫苗（egg based quadrivalent influenza vaccine，QIVe）以裂解疫苗为主，裂解疫苗通过表面活性剂处理病毒，导致病毒破碎并片段化，保留了疫苗免疫原性的同时显著降低了不良反应。此外，国外也有亚单位疫苗上市，该疫苗进一步去除了病毒的其他结构蛋白，仅保留疫苗的有效成分，血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA），大大提高了疫苗的安全性，但免疫原性也受不同程度影响。从2012年开始，美国FDA批准了多个厂家的鸡胚四价流感病毒裂解疫苗上市。我国从2018年开始批准第一家企业的四价流感病毒裂解疫苗上市以来，至今已有7个厂家上市。目前，四价流感疫苗接种适应人群为6月龄以上人群。多个Ⅲ期临床试验结果显示，QIVe在婴幼儿、儿童、成年人和老年人中的免疫原性与两个对照的鸡胚三价流感疫苗（egg based trivalent influenza vaccine，TIVe）中相同型别抗原达成非劣效，而包含的另一个谱系B型抗原的免疫原性优效于TIVe中未包含的B型抗原［11-13］。新加入的另一谱系B型抗原未干扰其他抗原的免疫原性。在安全性方面，QIVe与TIVe不良反应发生率相当。在保护力临床研究方面，由于多个企业已在TIVe中评价了疫苗的保护效力，且TIVe与QIVe生产工艺相同，因此，大部分厂家QIVe的临床试验评价终点是采用免疫原性桥接的。也有部分厂家在易感人群，如3岁以下人群中开展了QIVe的保护效力研究［14］。2014年3月和2016年7月，在亚洲、拉丁美洲、欧洲和非洲的49个中心入组了5 806例未接种过流感疫苗和感染流感的6～35月龄婴幼儿，结果显示，针对任何A型或B型毒株引起流感的有效率为50.98%（97%CI：37.36%～61.86%），针对疫苗类似毒株引起流感的有效率为68.40%（97%CI：47.07%～81.92%）。在安全性方面，除了QIVe组中报告诱发注射部位反应的参与者比例［39.9%（95%CI：37.5%～42.4%）］高于安慰剂组［31.9%（95%CI：29.6%～34.2%）］外，各组报告诱发反应和不良事件的比例相似。英国GSK公司在3～8岁儿童中进一步评价了QIVe在预防中重度流感等方面的有效性，这些儿童随机接种QIVe或灭活甲型肝炎疫苗，结果显示，QIVe预防任何严重流感的有效性为55.4%（95%CI：39.1%～67.3%），对中重度流感（定义为体温＞39℃、急性中耳炎、下呼吸道疾病或严重肺外并发症）的有效性为73.1%（97.5%CI：47.1%～86.3%）。与对照组相比，QIVe疫苗接种组的流感病例通常具有轻微的临床症状，且就诊、住院、缺勤和父母缺勤的数量显著降低［15］。除此之外，也有学者分析了四价流感疫苗接种后的成本收益［16］。在秘鲁进行了一项从TIVe转换为QIVe的成本效益分析，并评估达到卫生部目标的疫苗接种覆盖率对健康和经济的影响，结果显示，采用QIVe替代TIVe可预防在＜2岁和＞60岁人群中29 126例新增病例（包括12 815例咨询）、54例住院病例和23例与流感相关的死亡病例，共节省约50.5万美元，由此产生的增量成本效益比（incremental cost effectiveness ratio，ICER）为16 649美元／质量调整寿命年。国内外已上市的QIVe见表1。

表1 国内外已上市的鸡胚四价流感疫苗Tab.1 QIVe marketed at home and abroad

2 高剂量QIVe

由于老年人免疫器官的衰老，导致现有标准剂量的流感疫苗对老年人保护效果较差。因此，针对老年人群这一特性群体，为提高流感疫苗的有效性，目前有两个策略：一个是增加抗原含量，另一个是加入佐剂［17-18］。目前，两种策略均有产品上市，其中高剂量四价流感裂解疫苗（HD-QIVe）为法国赛诺菲巴斯德公司研发并于2019年在美国批准上市，MF59佐剂四价流感亚单位疫苗为瑞士诺华公司（现为澳大利亚Sequris公司）研发，于2020年上市。

相比于标准剂量，高剂量QIVe中的HA含量为标准剂量的4倍，即每个型别的HA含量增加至60 μg，总量为240 μg，规格由标准的0.5 mL增加至0.7 mL。由于抗原含量的增加，提高了流感疫苗在老年人群的免疫原性和有效性。赛诺菲巴斯德公司开展的一项免疫原性为临床终点的Ⅲ期临床试验支持了该产品上市，试验结果显示，高剂量QIVe的GMT增长倍数、血清阳转率均非劣效于高剂量TIVe中相同型别的抗原，优效于高剂量TIVe中不含的另一种B型抗原［19］。目前尚无高剂量QIVe的保护力研究结果，但数据可从HD-TIVe中推断出来，因为两种疫苗均是使用相同工艺制备。一项在美国和加拿大进行的多中心、双盲、疗效试验中，65岁及以上的成年人被随机（1∶1）接种高剂量TIVe或标准剂量TIVe［20］。在两个流感季节（2011—2012年和2012—2013年）分别入组15 892和15 911名受试者。结果显示，针对实验室确认的由任何流感病毒引起的流感，在HD-TIVe组中有228名参与者（1.4%），而在TIVe组中有301名参与者（2.9%），相对疫苗有效性（relative vaccine effectiveness，rVE）为24.2%（95%CI：9.7%～36.5%），达到了优效标准。针对疫苗毒株相似的病毒引起的流感，rVE为51.1%（95%CI：16.8%～72.0%）。在对两个流感季节610万医疗保险受益人的数据分析和73 773名退伍军人队列收集的数据分析中，HD-TIVe在预防流感或肺炎相关住院（rVE为25%，95%CI：2%～43%）和全因门诊就诊（rVE为5%，95%CI：2%～8%）、预防感染后死亡（rVE为24.0%，95%CI：0.6%～42%）方面比TIVe更有效［21-22］。安全性方面并未由于抗原含量增加出现明显的不良反应，已有的安全性数据表明，高剂量QIVe与标准剂量的TIVe／QIVe、高剂量TIVe的总体不良反应发生率相当［19，23-24］。接种后3 d内发生的最常见的注射部位反应是疼痛、红斑、肿胀和硬化，而最常见的全身反应是肌痛、头痛、不适和颤抖。大多数引发的反应为轻度至中度，在接种后的前3 d内开始，并在发病后7 d内恢复［19，25］。目前，HD-QIVe未被许可用于65岁以下人群，且在妊娠、哺乳期和儿科尚未确定其安全性和有效性。

除了提高疫苗中HA含量之外，疫苗中添加佐剂也可提高疫苗的免疫原性。MF59佐剂是铝佐剂之外第2个批准用于人类疫苗的佐剂，首先于1997年在欧洲批准上市，随后MF59佐剂四价流感疫苗（aQIVe）2020年在美国获批用于65岁以上人群接种。MF59佐剂是一种水包油佐剂，主要成分为角鲨烯、司盘85和吐温80，平均粒径为165 nm。MF59免疫增强作用机理主要有以下方面：在注射部位诱导促炎性趋化因子如CXCL10和细胞因子，促进免疫细胞的募集，促进粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的有效抗原摄取，并使这些细胞分化［26］。MF59还能促进直接在引流淋巴结内从单核细胞分化为树突状细胞（dendritic cell，DC）［27］。此外，MF59参与形成生发中心反应，因为其诱导抗原特异性生发中心B细胞、B细胞反应的持续性和滤泡辅助T细胞的数量增加［28］。几项针对老年人的临床研究表明，与非佐剂流感疫苗相比，aTIVe虽未达到全部毒株的优效比较，但aTIVe对同源和异源流感毒株的抗体反应更强［29-31］。在流感相关并发症高风险的其他年龄组中，与传统亚单位疫苗相比，aTIVe还诱导了更强的抗体反应［32］。最近一项研究证实了aQIVe与未接种流感疫苗的成年人相比，在65岁或以上成年人中的临床疗效［33］。接种了aQIVe 3 381例受试者中，有122例（3.6%）经RT-PCR确诊为流感病例；3 380名对照组中，有151例（4.5%）流感病例。aQIVe对所有流感的有效性为19.8%（经多重性调整的95%CI：5.3%～38.9%），对抗原匹配毒株的有效性为49.9%（95%CI：24.0%～79.8%）。安全性方面，aTIVe组的不良反应发生率较高，但反应为轻度至中度和短暂［34］。最常见的局部不良事件是注射部位疼痛，aQIVe组（16.3%）略高于对照组（11.2%）。

3 鸡胚基质减毒QIV

流感减毒活疫苗（live attenuated influenza vaccine，LAIV）基于一种冷适应流感病毒的使用，该病毒在鸡胚中复制良好，且在低于正常人体温度下能正常增殖。而这些冷适应流感病毒主要在上呼吸道中进行增殖，因此毒性减弱。LAIV毒株通过经典重配制备，即由冷适应和鸡胚适应的高产毒株的内部基因与确定的相应季节性流感疫苗推荐毒株的HA和NA组合而成。由于免疫的是基于鼻内接种的减毒活病毒，其诱导强烈的局部黏膜IgA反应以及CD4+和CD8+T细胞应答［35-36］。成人LAIV诱导的总体保护水平与灭活流感疫苗诱导的相当，但LAIV在老年人中似乎不如IIV有效，而在儿童中似乎更有效。因此，这类疫苗的推荐使用年龄为2～49岁。由于LAIV接种依赖于减毒病毒在上呼吸道的增殖，这可能导致一些轻微的增殖相关症状，某些流感高危人群和孕妇也被禁止接种。2～17岁儿童以及18～49岁成人对四价LAIV与三价LAIV的非劣性临床研究显示，对四价LAIV的免疫反应均非劣于三价LAV。此外，在儿童中，四价LAIV诱导了对两种谱系的B型流感毒株的强烈免疫应答，而三价LAIV对交替B型流感谱系毒株的交叉反应免疫应答低于对疫苗中所含毒株的应答。在疫苗中加入额外的B型流感毒株不会干扰对疫苗中其他毒株的免疫反应。在儿童和成人中，四价LAIV的安全性与三价LAIV相当。2～8岁儿童中，与接种三价LAIV的儿童（3.1%）相比，接种四价LAIV（5.4%）的儿童更常见发热。在成人中，流鼻涕或鼻塞是最常见的症状。接种四价或三价LAIV的两组之间报告的不良事件相同。成人组报告的最常见不良事件为打喷嚏、口咽疼痛、上呼吸道感染和咳嗽，而儿童组报告的呕吐为最常见的不良事件［37-38］。

4 MDCK细胞QIV

用于季节性流感疫苗的传统鸡胚制备技术有如下缺点：缺乏灵活性、依赖鸡蛋供应、污染风险及鸡胚适应性病毒突变等。为了克服这些缺点，欧盟和FDA批准了基于MDCK细胞的流感亚单位疫苗。大量的临床数据表明，细胞流感疫苗在免疫原性、安全性和耐受性方面与鸡胚流感疫苗相当［39-41］。而在上市之初至2016年之前，细胞流感疫苗所用毒株仍为鸡胚源毒种，此毒种仍为鸡胚适应毒株，适应性突变的风险未根本解决，可能仅减缓了突变的速度，这显然降低了细胞流感疫苗的优势。2016年，FDA首次批准了MDCK细胞用于WHO合作国家流感中心的临床样品毒株分离以及疫苗株制备。从2017—2018年流感季开始，WHO增加了细胞源性季节性流感疫苗毒株推荐（H3N2毒株采用细胞源毒株，其他仍为鸡胚源）［42］。之后，生产厂家首次对2～17岁儿童和青少年进行了MDCK细胞基质的四价流感病毒亚单位疫苗的绝对疫苗有效性（absolute vaccine effectiveness，aVE）研究。这是一项多国、随机、非流感疫苗对照，在3个流感季节中的8个国家进行的流感疫苗有效性、免疫原性和安全性研究［43］。该研究入组了4 513名儿童和青少年，其中，2 258名受试者接种了FLUCELVAX四价流感疫苗，2 255名受试者接种了四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗。结果显示，细胞四价流感疫苗（cell based quad-rivalent influenza vaccine，QIVc）组中有175名（7.8%）发生实验室确认的流感，对照组中有364名（16.2%）发生实验室确诊的流感，QIVc的aVE为54.6%（95%CI：45.7%～62.1%）。对甲型流感／H1N1的有效性为80.7%（95%CI：69.2%～87.9%），对流感A／H3N2的有效性为42.1%（95%CI：20.3%～57.9%），而对乙型流感的有效性则为47.6%（95%CI：31.4%～60.0%）。QIVc组和对照组的不良事件发生率相似。

此外，多个国家比较了QIVc与鸡胚流感疫苗的保护性。有研究表明，采用QIVc毒株后，QIVc的有效性相比于鸡胚流感疫苗提升。如来自医疗保险和医疗补助服务中心的一项研究表明，对于65岁人群，QIVc比鸡胚流感疫苗在预防流感住院方面的效果提高了10%［44］。北加州凯撒永久医院（Kaiser Permanente in Northern California，KPNC）在2017—2018年流感季节期间比较了QIVc与TIVe／QIVe的保护效力［45］。结果显示，QIVc与TIVe／QIVe相比，rVE为8%（95%CI：10%～23%）。与未接种相比，QIVc和TIVe／QIVe的aVE分别为31.7%（95%CI：18.7%～42.6%）和20.1%（95%CI：14.5%～25.4%）。QIVc和TIVe疫苗经调整的抗B型流感病毒的aVE分别为40.9%（95%CI：30.0%～50.1%）和9.7%（95%CI：3.5%～15.6%）。从2019—2020年流感季节开始，WHO推荐了4个型别的细胞源毒种，QIVc生产工艺彻底摆脱了鸡胚源毒种。在成本效益评估研究中，与QIVe相比，QIVc对与流感相关的住院／急诊（emergency room，ER）就诊、全因住院及与任何呼吸事件相关的住院／ER就诊的调整后rVE更高。与QIVc相比，QIVe的调整后年度化全因总成本更高（±461美元，P<0.05）［46］。2019—2020年，美国进行了一项流感季节QIVc与标准QIVe的现实世界临床和收益比较分析［47］，该回顾性分析评估了2019—2020年流感季节美国4～64岁受试者分别接种QIVc与标准QIVe的rVE，结果显示，在逆概率处理加权（inverse probability of treatment weighting，IPTW）调整后，最终样本包括1 150 134 QIVc和3 924 819 QIVe受试人群，与QIVe相比，QIVc在预防流感相关住院／ER就诊以及呼吸相关住院／ER就诊方面更有效。

5 重组四价流感亚单位疫苗

如前所述，鸡胚和MDCK细胞基质流感疫苗均为灭活疫苗，两个生产体系均需WHO提供疫苗毒种，每年生产时，毒种的获取也影响疫苗的生产及上市时间。此外，虽然细胞流感疫苗可解决或避免鸡胚适应性突变问题，但毒种在细胞中传代也存在一定的突变概率。而采用基因重组技术可完全避免该问题。2016年，FDA批准了重组四价流感疫苗（quadrivalent recombinant influenza vaccine，RIV4）上市，这是一种仅使用重组杆状病毒-昆虫细胞制备的重组四价流感HA疫苗。该疫苗每种流感亚型的HA含量为45 μg，为标准剂量的3倍。RIV4相比于灭活和减毒流感疫苗，具有以下优点：生产周期短，在WHO公布毒种序列后，即可投入生产，可快速实现疫苗上市及响应流感大流行；完全摆脱对鸡胚的依赖，RIV4生产工艺中无化学病毒灭活处理，进一步保证了抗原性和免疫原性不被破坏；HA序列与推荐疫苗株保持一致，完全避免了疫苗毒株的适应性突变风险，提高了与流行株的抗原匹配性。

在两项Ⅲ期随机对照试验中证实了新一代RIV4的安全性、免疫原性和有效性［48-49］。在其中一项临床试验中，共入组9 003名50岁以上的志愿者，分别接种RIV4和标准剂量的鸡胚灭活疫苗，比较两组志愿者在接种疫苗14 d后至流感季结束之间的流感发生率。结果显示，标准剂量的鸡胚灭活疫苗组有3.2%感染流感，而RIV4组只有2.2%，因此，在50岁及以上成人中，与标准剂量QIVe相比，RIV4具有更高的保护能力，可将患流感的风险进一步降低30%。此外，对于经培养证实的流感样疾病，与QIVe相比，RIV4的rVE为43%（95%CI：21%～59%）。有研究表明，即使VE适度增加5个百分点，也可在2017—2018年美国流感季节预防1 050 000例患病和25 000例住院［50］。但有效性提高的原因很难区分是疫苗含有3倍标准剂量的HA抗原含量和／或缺乏鸡胚适应的原因。安全性方面，在每个疫苗组中，约一半的受试者报告注射部位疼痛和压痛，通常为轻度。接种RIV4后，注射部位红斑（两组中大多数为轻度）比QIVe更频繁（P=0.002），但RIV4参与者发生率不到5%。女性对疫苗注射的局部反应明显高于男性，但在疫苗组之间无差异。全身反应的报告频率远低于注射部位反应；大多数严重程度为轻度至中度，组间差异无统计学意义。

6 小结及展望

当前，在新冠全球流行的大背景下，同为呼吸道传染性疾病的流感威胁一直存在。而且流感在2022年卷土重来，人类会面临更高的新冠和流感叠加流行的风险。接种四价流感疫苗除了提供更全面的保护之外，同时也可减轻新冠防控的压力。虽然当前季节性四价流感疫苗的有效性未达到理想的保护效果，但多项现实世界的回顾性分析表明了四价流感疫苗在预防流感、降低流感流行、门诊率、住院率和死亡率方面起到了重要作用。特别是对婴幼儿和老年人等高危人群的保护效果更明显。目前，虽然QIVe仍为市场主流产品，但其他新型四价流感疫苗也陆续上市，能够解决鸡胚流感疫苗存在的缺陷，且在疫苗有效性方面显示出更高的保护效果和安全性。但流感疫苗的有效性受多方面因素影响，如疫苗毒株与流行毒株的匹配性、接种人群接种历史及感染情况、接种人群的免疫力、以及不同地区的流感流行程度等［51-52］。因此，仍需大量、全面的临床保护力对比研究，以更加全面、科学地评估这些新型四价流感疫苗的有效性和安全性。此外，疫苗免疫原性、有效性评价方法应能更好地评估疫苗的真实效果。如当前流感疫苗的免疫原性主要通过血凝抑制抗体（hemagglutination inhibition antibody，HI）作为主要评价指标，仍需补充其他评价方法，如微量中和抗体、NA抑制抗体、T细胞免疫水平等。还有多种新型的四价流感疫苗也进入临床不同阶段，如利用植物表达的重组VLP颗粒四价流感疫苗、基于新型佐剂皂苷的重组HA蛋白颗粒疫苗以及mRNA疫苗［53-55］。期望这些新型四价流感疫苗能够进一步提高疫苗的有效性和持久性，以应对流感季节性流行和大流行，为保护全球免受流感威胁提供保障。