双氢青蒿素对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖和活性的影响

蔡安盛，栗志英*，张素华，姚晓华，杜相珠，行红燕，郭永泽，马景红

(1.河北工程大学附属医院 a心内科；b 消化内科，河北 邯郸056002；2.邯郸市第一医院 a心内科；b 风湿免疫科；c 血液科)

心肌纤维化是心脏由于缺氧、炎性反应、代谢异常等原因所致的心脏组织中基质成分过度聚集，其中胶原成分所占比例过多且排列紊乱[1-2]，常见的并发症为心肌代偿性肥大、心律失常、心室重构，严重者会导致心衰，发病机制尚不明晰。多项研究证实血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)能加速心肌组织发生纤维化改变[3-4]。双氢青蒿素(DHA)能改善肺脏和肝脏的纤维化病变[5-6]。本实验利用AngⅡ刺激心肌成纤维细胞构建纤维化细胞模型，观察和分析双氢青蒿素对其增殖和分泌活性的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

出生1-3 d的SD大鼠，河北医科大学组胚教研室赠送。AngII 购于深圳子科生物有限公司，DHA 购于浙江新和成股份有限公司；波形蛋白、α-SMA和TGF-β1蛋白的第一抗体购于Invitrogen公司，酶联免疫吸附法试剂盒均购于圣克鲁斯生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1分离并培养心肌成纤维细胞 将10只出生时间为1-3 d的SD乳大鼠，低温麻醉后立即全身喷酒精进行消毒，在无菌实验室中迅速剪开胸部摘取心脏，切取心室组织，清洗血液后浸入低温D-Hank’s里，剪为尽可能的小块，浸入胰酶中消化心室组织中的细胞，滤网过滤组织残渣，滤液盛入离心管中，置半径为6 cm低温离心机内，600 r/min离心10 min。用孵育液悬浮细胞后培养，根据差时贴壁法对心肌成纤维细胞进行纯化并常规培养，2 d后观察其形态和结构并进行免疫鉴定。

1.2.2实验分组 培养的细胞分组：对照组、AngⅡ组、DHA组和DHA+AngⅡ组。对照组:只加入培养液；AngⅡ组：培养液中含有10-6mol/L AngⅡ；DHA组：培养液中含有100 ng/mL DHA；DHA+AngⅡ组：培养液中含有10-6mol/L AngⅡ和100 ng/mL DHA。

1.2.3每组细胞的增殖情况 将细胞用孵育液调制成5×104个/ml，移种于多孔孵育板里，每孔的量均为200 μl，孵育24 h让细胞生长在同步化状态，将上述各组重复安排6个孔，孵育48 h后，再向每孔加入适量的噻唑兰溶液,作用4 h。吸净孔内的悬浮液，再加均量的二甲基亚砜，充分反应后于酶标仪中测量出各孔吸光度值。

1.2.4细胞培养液中FN和Col I的分泌情况 4组细胞孵育3 d 时，各组重复安排6个孔，吸取每组的悬浮液，依次遵循试剂盒内的操作方法，波长值设置在450 nm处，上机进行检测，记录并计算各组的吸光度平均值。

1.2.5免疫印迹法分析细胞中α-SMA和TGF-β1蛋白的表达 4组细胞孵育3 d 时，裂解并获得每组胞质内的蛋白质，将其60 μg溶于5倍SDS溶液，沸水浴里变性后，移入夹板的凝胶孔内，电泳2 h后，切取包含有蛋白条带的凝胶块，将其和PVDF膜紧贴在一起放入转膜仪中1 h，逐次移入封闭溶液内孵育2 h、a-SMA(1∶800)及TGF-β1(1∶600)抗体稀释液内作用4 h，浸入洗膜液，取出后滴加二抗溶液(1∶1000)孵育2 h，重复洗膜三次，暗室内在膜上滴加发光液，于胶片上进行化学显色。利用图像分析仪确定每个条带的灰度值。

2 结果

2.1 细胞形态结构与性质鉴定获得的细胞纯度约为93%，培养瓶中的细胞在镜下可见：细胞紧贴瓶壁生长，第3天时可见细胞体积变大，从胞体伸出长短、粗细不等突起，单个圆形核，位于细胞中央。波形蛋白抗体染色可见：胞质内有许多棕色颗粒，见图1。

图1 上皮细胞的形态结构与性质鉴定(×200)

2.2 细胞增殖分析各组细胞3 d后，各孔的吸光度值显示：与对照组相比，DHA组没有显著差异(P>0.05)，AngⅡ组的吸光度值上升(P<0.05)；与AngⅡ组相比，DHA+AngⅡ组吸光度值下降(P<0.05)，见表1。

2.3 FN及Col I的含量分析与对照组相比，DHA组FN及Col I的释放量均无明显差异(P>0.05)，AngⅡ组两种蛋白的释放量均明显升高(P<0.05)；与AngⅡ组比较，DHA+AngⅡ组两种蛋白的释放量均明显降低(P<0.05)，见表1。

表1 细胞增殖实验与细胞分泌物检测结果分析

2.4 细胞中α-SMA和TGF-β1蛋白含量的分析与对照组相比，DHA组胞质内α-SMA和TGF-β1含量均没有明显差异(P>0.05)，AngⅡ组两种蛋白的量均明显升高(P<0.05)；与AngⅡ组比较，DHA+AngⅡ组两种蛋白的量明显降低(P<0.05)，见图2、表2。

表2 免疫印迹法检测细胞中α-SMA和TGF-β1的相对含量

图2 免疫印迹法显示细胞中α-SMA和TGF-β1蛋白的灰度条带

3 讨论

心肌纤维化是多种致病因素共同作用引起的较为复杂的病理生理过程，在此过程中主要是心肌组织中的间质细胞参与[7-8]。成纤维细胞为间质细胞中的成员之一，在心肌纤维化病变的过程中发挥着重要作用。在损伤信号的刺激下，其具体的作用机制如下：①细胞分裂增殖、数量增多；②活性增强，分泌基质成分增多；③其表型转分化为肌成纤维细胞，其增殖程度和分泌基质的活性均较成纤维细胞增强[9-10]。因此，本研究分离乳鼠的心肌成纤维细胞作为研究对象。

血管紧张素Ⅱ为神经体液调节因子，在心肌纤维化病变的进展中发挥着重要作用。当心肌细胞收缩力降低造成心排血量减少时，流经肾脏的血量也相应的减少，引起机体中Ang Ⅱ生成和释放入血。Ang Ⅱ能刺激心肌组织中的成纤维细胞，使其增殖分裂和过度活化，大量表达肌成纤维细胞的表型分子—a-SMA，分泌的基质成分增多，并能分泌大量的致纤维化因子TGF-β1、IGF-1等，通过多种信号调节途径，进一步加速了心肌纤维化的进程[11-13]。该实验结果表明：在体外，AngⅡ能刺激心肌成纤维细胞数目增加，分泌到孵育液中的FN和Col I含量增多，细胞中a-SMA的表达上升，TGF-β1的含量也增加。这与文献[11-13]的研究结果相一致。

青蒿素为众所周知的有效抗疟药物，双氢青蒿素为其衍生物，它能治疗疟疾外，还具有抑制肿瘤、减弱炎性反应、调节机体免疫等多种生物功效[14-16]。采用四氯化碳对小鼠进行肝纤维化造模过程中，经过适量的双氢青蒿素干预能减少肝组织中促进纤维化的细胞因子TGF-β1和TNF-α的含量，从而改善肝组织纤维化的程度[17]。在细胞实验中，TGF-β1能诱导子宫内膜上皮细胞发生间质化、间质细胞分泌基质活性增强，而双氢青蒿素能拮抗TGF-β1的这种效应，达到防治宫腔粘连的作用[18-19]。该实验结果表明，双氢青蒿素对AngⅡ刺激的心肌成纤维细胞增殖、分泌FN和Col I、表达a-SMA和TGF-β1具有抑制作用。这提示双氢青蒿素能有效拮抗AngⅡ引发的心肌纤维化。