改性木质素磺酸钠基竹叶黄酮纳米胶体球的制备及防晒性能*

陈丽欢，谷炎培，张 英

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江省农产品加工技术研究重点实验室，浙江省食品加工技术与装备工程研究中心，浙江 杭州 310058)

人体长期或高剂量暴露于紫外辐射会导致如红斑、烧伤、炎症激活和皮肤癌等危害[1]。商业防晒产品分为物理防晒霜和化学防晒霜。物理防晒剂主要是氧化锌和二氧化钛，通过反射和散射来阻挡UV辐射，过程中产生ROS，具有细胞毒性、遗传毒性。而化学防晒剂通常是与羰基结合的具有共轭基团的低分子量芳香族化合物，这种化学结构有利于π-π电子的跃迁，因此具有很强的紫外吸收作用，分为UVA和UVB类过滤器[2]。由于这些成分具有光稳定性和毒性，可破坏海洋生态系统[3]，同时长期使用易对人体产生副作用[4]。因此开发环保、广谱、高效的防晒活性成分是目前研究的热点。

竹叶黄酮(Bamboo-leaf flavone，BLF)是新型植物黄酮制剂，其主要功效成分为碳苷黄酮，包括四种特征性化合物：荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷[5]。竹叶黄酮在波长为240～290 nm(带II)和300～350 nm(带I)处有两条吸收带，具有清除自由基、抗衰老、抗辐射、紫外吸收等多重生物学功效[6]，已部分应用于保健食品和日化行业。但由于竹叶黄酮色泽深、精度低，限制了其在护肤品中的应用[7]。

木质素是自然界中唯一可直接提供芳环的可再生能源[8]，具有价格低廉、热稳定性好、可降解等特点[9-10]。木质素含有酚、酮等紫外吸收基团，在防晒领域具有巨大应用潜力[11-16]。但由于工业木质素颜色较深、无规团聚、表面极性不均匀等缺点[15]，限制了其在高端护肤品中的应用。

为降低木质素色泽，Lee等[17]在温和条件下使用二氧六环萃取分离得到浅色木质素(比约克曼木质素)，其紫外吸收效果并未减弱[18]，但由于高能耗、低生产率，比约克曼木质素难以大量生产；Zhang等[19]通过甲醇/水分馏和乙酰化，阻断游离羟基，使木质素的亮度值(L值)提高313.5%，然而其紫外吸收能力大幅减弱。木质素作为天然的两亲聚合物，在适当体系中可通过非共价力自组装形成胶束[15]，显著增强其紫外防护效果[12，15，20-21]。但单一的木质素不足以达到预期的防晒效果。Qian等[22]认为木质素与商业防晒因子存在协同作用关系，极大增强其UV吸收率。

本文在前期研究基础上，以高纯度竹叶黄酮、改性木质素磺酸钠和壳聚糖为原料，通过自组装制得具有更浅色泽、更强生物学活性的复合纳米胶体球。同时对改性木质素磺酸钠基竹叶黄酮纳米胶体球的观、结构和防晒性能进行表征。以期在大幅度提升BLF70生物学活性和外观色泽的同时，通过与木质素的协同作用，获得天然、绿色、安全的新型复合防晒功能因子。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

竹叶黄酮(RP-HPLC 法测得其4个碳苷质量分数为75.7%，BLF70)，实验室自提；木质素磺酸钠(LS)，杭州通利源科技有限公司；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，国药集团化学试剂有限公司；壳聚糖(CS)，美国麦克林公司；纳米氧化锌[含量>99.8%，(50±10) nm]、纳米二氧化钛(含量> 99.8%，40 nm)、BMDM(含量>98.0%)、OMC(含量>97.0%)，美国macklin公司；甲醇，色谱纯，美国 sigma公司；乙醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；正己烷，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

Centrifuge 5810 R型 超速冷冻离心机，德国eppendorf公司；Waters e 2695 高效液相色谱仪，美国 Waters 公司；RE-52AA 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；CS-10彩谱色差仪，中国彩谱公司；Zetasizer Nano ZS90 纳米粒度及Zeta电位分析仪，英国Malvern公司；Gemini SEM 300场发射扫描电子显微镜，德国Zeiss公司；Cary 60紫外可见光分光光度计，美国agilent公司； Nicolet IS 50 傅里叶变换红外光谱计，美国Thermo公司；DSC1 差示扫描量热仪，瑞士Mettler公司；UV 3600紫外分光光度计(带积分球)，日本Shimadzu公司。

1.2 方 法

1.2.1 木质素磺酸钠的改性与胶束化

参考Li[21]的方法，将60wt%的木质素磺酸钠水溶液和50wt%的CTAB乙醇溶液按溶质质量比2.82∶1均匀混合，形成阴阳离子复合溶液；在搅拌条件下以1.2 mL/s的速率加入2000 mL水后静置24 h，沉淀物冷冻干燥即得改性木质素磺酸钠壁材(LS/CTAB)。

将无水乙醇-正己烷体系作为胶体球形成条件。称取一定质量高纯度竹叶黄酮(BLF70)和LS/CTAB溶于无水乙醇中，超声溶解。在低速磁力搅拌的条件下，将正己烷通过恒流泵以一定速度滴入BLF70-LS/CTAB醇溶液中。继续低速磁力搅拌10 min，得改性木质素磺酸钠基竹叶黄酮纳米胶体球混悬液(NSLS/BLF)。

在单因素实验的基础上，采用正交实验优化NSLS/BLF的制备工艺参数。以BLF70包封率为响应值，对LS/CTAB浓度(A)、LS/CTAB与BLF70质量比(B)、溶液体系中正己烷含量(C)、恒流泵流速(D)进行L16(44)正交实验，因素配置水平如表1所示。

表1 正交试验的因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.2 NSLS/BLF的碳苷黄酮包埋效果评价

采用HPLC法测定NSLS/BLF对BLF70的包封率。色谱条件参考Zhang等[5]的方法并做适当改进：Luna C18色谱柱，波长扫描范围200～400 nm，定量波长330 nm，柱温35 ℃，流速 0.5 mL/min，进样量20 μL，流动相为甲醇(A)/水(B)，梯度洗脱条件为(体积分数)28% A 与 72% B(0～10 min)，48% A 与 52% B(10～40 min)。

配制0.01 g/L、0.05 g/L、0.1 g/L、0.5 g/L、1 g/L的BLF70标准溶液，使用0.22 μm微孔滤膜过滤器过滤后，进样20 μL，采用用峰面积归一化法绘制标准曲线。取3 mL NSLS/BLF悬浊液于截留分子量为10 kD的离心超滤管中，离心(4000 r/min)30 min后，取下部滤出液进样，按如下公式计算包封率(η)：

η=(m0-m1)/m0×100%

式中，η为包封率，%；m0为样品中BLF70总质量，mg；m1为样品中游离BLF70质量，mg。

1.2.3 NSLS/BLF的漂白

取壳聚糖(CS)溶于1%乙酸溶液中，加热搅拌至 CS 完全溶解。将NSLS/BLF通过恒流泵以一定速度滴入CS溶液中，使CS ： LS/CTAB(m/m)分别为0%、0.5%、1%、3%、6%、12%、18%、24%。搅拌5 h后，真空冷冻干燥 48 h，得漂白后改性木质素磺酸钠基竹叶黄酮纳米胶体球(NSLS/BLF/CS)。以亨特白度、外观、复溶时间、复溶后外观为指标，考察不同CS添加剂量对NSLS/BLF/CS漂白效果和品质的影响。

使用彩谱色差仪分析各个样品的亨特白度。在3个随机位置测量每个样品的L(亮度)、a(红色)和b(黄色)值，记录并计算平均值。亨特白度(W)根据以下等式计算[23]：

式中，L、a、b是各个样品的颜色值。

1.2.4 NSLS/BLF/CS的表征

紫外光谱：配制一定浓度的样品醇溶液，吸取1.5 mL至石英比色皿，扫描波长范围为240～400 nm。波长范围 200～400 nm。FTIR：采用溴化钾压片法，分辨率4 cm-1，扫描次数32次，扫描范围为4000～400 cm-1。DSC：扫描范围为20～350 ℃，升温速度 10 ℃/min，氮气流速30 mL/min。粒径及电位测定：采用粒径及电位分析仪测定，重复3次实验。

1.2.5 NSLS/BLF/CS的紫外吸收活性

分别将BLF70(2.5%、5%、7.5%)、NSLS/BLF/CS(2.5%、5%、7.5%)与无防护作用的空白霜(水、甘油、矿脂、二辛基醚、聚二甲基硅氧烷、甘油硬脂酸酯、鲸蜡醇、甜扁桃油、PEG-30硬脂酸酯、生育酚乙酸酯、聚二甲基硅氧烷醇、苯甲醇、苯氧乙醇、甘油丙烯酸酯/丙烯酸共聚物、丙二醇、EDTA二钠、氢氧化钠、葵花籽油)混合后，置于磁力搅拌器上，在25 ℃下以250 rpm的搅拌速度避光搅拌5 h，得到含有不同防晒成分的防晒霜。

将3 M医用胶带黏贴在2 mm厚的干净石英载玻片上，利用注射器将防晒霜样品均匀点滴在胶带表面，样品在胶带表面的分布为2 mg/cm2。将涂抹好样品的玻片避光干燥20 min，利用紫外积分球检测器对其扫描，测试紫外透过率。扫描波长范围为280～400 nm，取点间隔为1 nm，每个样品重复测试3次[24]。样品的SPF值通过下列等式计算[25]：

式中，Eλ表示CIE红斑光谱有效性；Sλ表示太阳光谱辐照度；Tλ表示样品的光谱透射率。

1.2.6 统计学方法

采用SPSS 24.0软件进行实验数据分析，计算结果以平均值±标准差(Mean ± SD)表示。

2 结果与讨论

2.1 NSLS/BLF的制备参数优化

采用用峰面积归一化法制得BLF70标准曲线为：

y=3.951300x-143420(r=0.996，n=5)

式中，y为BLF70峰面积；x为BLF70浓度，mg/mL。

正交实验中各组的包封率及其分析结果如表2所示。选取正交结果最优条件A2B2C1D4、k值最优结果A2B2C3D4进行验证试验。通过3次重复试验可知，正交最优条件得出NSLS/BLF的平均包封率为(80.57±0.55)%，高于k值最优条件平均包封率(70.45±0.97)%。因此优化后NSLS/BLF的制备参数为：LS/CTAB浓度3 g/L、LS/CTAB与BLF70质量比10:1、正己烷含量35%、恒流泵流速700 μL/s，此时包封率为(80.57±0.55)%，且各因素对包封率影响程度的主次顺序为B(LS/CTAB与BLF70质量比)> A(LS/CTAB浓度)> C(正己烷含量)> D(恒流泵流速)。

表2 自组装制备NSLS/BLF的正交试验结果及分析Table 2 Orthogonal experiment results of NSLS/BLF prepared by self-assembled

续表2

2.2 壳聚糖添加量对NSLS/BLF/CS色泽和质构的影响

如图1(a) 所示，不添加CS的NSLS/BLF/CS白度极低，且冻干后呈针晶状，极大限制其在高端化妆品中的使用。

如表3所示，CS添加量为0%～1% CS时，NSLS/BLF/CS白度具有显著性差异，添加1%CS后样品的亨特白度提高230.56%；同时NSLS/BLF/CS外观从针晶状转变为蓬松粉末状，且复溶时间短、复溶后溶液保持均匀半透明状。当CS添加量为1%～24% CS时，NSLS/BLF/CS白度提高不明显，且样品外观从蓬松粉末状转变为絮状，复溶时间延长、溶液混浊。

这说明添加低浓度壳聚糖在改善色泽和质构上起重要作用。因此，CS的最佳添加量为1%。

表3 添加不同量壳聚糖对NSLS/BLF/CS色泽和质构的影响Table 3 Effect of the amount of CS on the color reduction and texture improvement of NSLS/BLF/CS

图1 添加不同量壳聚糖(w/w)后NSLS/BLF/CS的外观Fig.1 Appearance of NSLS/BLF/CS with different amount of CS

2.3 NSLS/BLF/CS的表征

2.3.1 NSLS/BLF/CS的组成

在最佳制备参数下(即LS/CTAB浓度3 g/L、LS/CTAB与BLF70质量比10:1、正己烷含量35%、恒流泵流速700 μL/s、壳聚糖添加量1%)，BLF70的包封率为(80.57±0.55)%，此时NSLS/BLF/CS的组分构成如下：7.2%～9%的竹叶碳苷黄酮，90.1%～91.8%的改性木质素磺酸钠，0.9%～0.91%的壳聚糖。

2.3.2 外观、粒径及电位测定

NSLS/BLF/CS的粒径和电位分布曲线如图2所示。NSLS/BLF/CS粒径范围为164～712 nm，重复三次实验测得平均粒径为(402.5±21.0) nm，多分散指数(PDI)为0.351±0.006，这说明其分布较为均一。NSLS/BLF/CS的电位范围为-33～-0.4 mV，平均电位为(-22.1±1.47) mV。

图2 NSLS/BLF的粒径和电位分布曲线Fig.2 Particle size distribution and average potential of NSLS/BLF/CS

NSLS/BLF/CS的SEM图像见图3。如图3所示，NSLS/BLF/CS的形态规则，呈球形或类球形，大小较均匀。

图3 NSLS/BLF的SEM照片Fig.3 SEM image of NSLS/BLF/CS

2.3.3 紫外光谱

图4为BLF70、LS/CTAB 、NSLS/BLF/CS的紫外吸收光谱图。如图所示，LS/CTAB仅在280 nm出现最强吸收峰，而BLF70和NSLS/BLF/CS在270 nm和330 nm附近均出现典型竹叶碳苷黄酮带Ⅰ和带Ⅱ吸收峰，初步说明BLF70与LS/CTAB发生交合作用。

图4 BLF70、LS/CTAB、NSLS/BLF/CS的紫外吸收光谱图Fig.4 UV absorption spectra of BLF70， LS/CTAB and NSLS/BLF/CS

2.3.4 红外光谱

底物(BLF70、LS/CTAB)和产物(NSLS/BLF/CS)的红外吸收光谱图见图5所示。NSLS/BLF/CS的主要特征峰包括：3424 cm-1的O-H伸缩振动峰、2921 cm-1的C-H反称伸缩振动峰和 2851 cm-1的C-H对称伸缩振动峰，存在LS/CTAB的特征吸收峰，如1037 cm-1的芳醚=C-O-C对称伸缩振动峰及其他弯曲振动峰(1464 cm-1的烷烃-CH面内弯曲振动峰、1425 cm-1的烯烃-CH面内弯曲振动峰、1329 cm-1的-OH面内弯曲振动峰)，同时存在部分BLF70的特征吸收峰，如1707 cm-1的C=O 伸缩振动峰，1612 cm-1和1517 cm-1的苯环骨架振动峰， 1116 cm-1的酚类ɑ-O 伸缩振动峰，但这些特征吸收峰强度明显降低，且弯曲振动的指纹区域部分消失，如1459、1352和1077 cm-1等，这表明BLF70与 LS/CTAB分子间发生相互作用， LS/CTAB自组装后包埋BLF70形成了纳米胶体球。

图5 BLF70 、LS/CTAB 、NSLS/BLF/CS 的红外吸收光谱图Fig.5 FTIR spectra of BLF70， LS/CTAB and NSLS/BLF/CS

2.3.5 差式扫描量热分析

BLF70、LS/CTAB 和NSLS/BLF/CS的差式扫描量热分析曲线图见图6所示。从图中可知，三者均有两个吸热峰，分别为失水峰和熔融峰。BLF70的熔融曲线光滑，熔融温度为112.58 ℃，热焓值为 21.9 J/g；LS/CTAB的熔融曲线光滑，熔融温度为254.05 ℃，热焓值为 75.47 J/g；而NSLS/BLF/CS仅存在一个熔融峰，表明BLF70与LS/CTAB已通过自组装形成均一胶体，这与红外光谱分析结果一致；BLF70和LS/CTAB的相互作用提高两者的稳定性，因此NSLS/BLF/CS的熔融温度提高至260.88 ℃，热焓值提高至 82.54 J/g；NSLS/BLF/CS熔融曲线不光滑，可能是由于不同颗粒尺寸(164～712 nm)的熔融速率不同导致的。

图6 BLF70 、LS/CTAB 、NSLS/BLF/CS 的差式扫描量热分析曲线图Fig.6 DSC spectra of BLF70， LS/CTAB and NSLS/BLF/CS

2.4 NSLS/BLF/CS的紫外吸收活性

如图7 所示，防晒乳液的SPF值随BLF70和NSLS/BLF/CS质量分数的增加而增加，且含NSLS/BLF/CS的防晒乳液SPF值增速更快。当两者添加量均为7.5%时，含NSLS/BLF/CS防晒霜的SPF值是含BLF70的2.63倍，这说明通过自组装制得的NSLS/BLF/CS明显提高了BLF70的防晒性能。

图7 防晒霜的SPF 值与BLF70、NSLS/BLF/CS添加量的关系图Fig.7 The SPF value of the pure creams blended with different amounts of BLF70 or NSLS/BLF/CS

3 结 论

本文将高精度竹叶黄酮与木质素复配。对木质素磺酸钠疏水改性，于无水乙醇-正己烷体系中自组装，在改善色泽的同时，解决了木质素无规团聚、表面极性不均匀等问题。通过正交试验可知最佳制备参数为：LS/CTAB浓度3 g/L、LS/CTAB与BLF70质量比10∶1、正己烷含量35%、恒流泵流速700 μL/s，此条件下纳米胶体球包埋率为(80.57±0.55)%。将壳聚糖作为降色剂吸附于纳米胶体球表面，当添加量为1%时，纳米胶体球的亨特白度提高230.56%。此纳米胶体球有助于解决竹叶黄酮和木质素在化妆品应用中普遍存在的产品色泽差的问题。含NSLS/BLF/CS防晒霜的SPF值是含BLF70的2.63倍，即通过自组装制得的NSLS/BLF/CS明显提高了BLF70的防晒性能，因此NSLS/BLF/CS在日化产品，尤其是防晒产品中具有良好的应用前景。而纳米胶体球与现有的物理、化学防晒剂是否存在协同作用，以及该纳米胶体球的其他生物学活性有待进一步探究。