液质联用法测定南美白对虾中84种农药残留

项爱丽，段晓然，马瑞欣，张谊，汤思凝*，周鑫*

1. 唐山市食品药品综合检验检测中心（唐山 063000）；2. 河北省水产技术推广总站（石家庄 050000）

水产品的质量安全问题日益受到政府、消费者的关注[1]。水产品中的渔药残留、毒素类、重金属等物质超标，可能对人体健康产生不利影响，因此这些化学污染物受到广泛监测或控制[2-5]。近年来，动物源性食品中的农药、杀虫剂等药物残留受到广泛重视[6-8]，GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》增加动物源性食品农药残留限量的食品种类和药物种类。水产品中的农药残留可能来源于混合养殖模式的推广[6]、降雨降水、陆地径流和大气循环等途径[9]。这些药物通过大气、水文和农业生态系统进入食物链，可能间接威胁人类健康[10]。然而，对动物源性食品中的农药残留的研究并不甚多。

农药残留的分析方法以气相色谱-质谱法（GCMS/MS）和液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）技术应用最广[11-12]。超高效液相色谱串联质谱法（UHPLC-MS/MS）具有抗干扰能力强、灵敏度高、检测效率高等优点[13]。SCRS固相萃取柱，是在QuEChERS方法基础上开发出的对样品提取液进行净化的前处理耗材，能实现单步净化[14]。

试验建立固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法，对南美白对虾中的农药多残留进行测定方法的开发，通过优化样品前处理的操作条件和仪器参数，实现快捷高效、准确可靠测定84种农药残留的目的，为实验室测定水产品中农药残留提供方法支持，对评估农药残留对水产品的风险、持续监测水产品中残留物和进一步评估对人体健康危害提供支撑。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

乙腈、甲醇（色谱纯，Dikma公司）；甲酸（色谱纯，Thermo Fisher公司）；二甲基亚砜（DMSO）、氯化钠（国产优级纯）；试验用水为超纯水（电阻率18.25 MΩ·cm）。

SCRS固相萃取柱（天津赛恩博瑞科技有限公司）；微孔滤膜（0.22 μm），亲水性聚四氟乙烯（WWPTFE）膜，PALL公司。

84种农药残留标准品（天津阿尔塔公司）。

1.2 标准溶液配制

准确吸取适量农药标准品，用乙腈稀释并定容，配制成1 μg/mL的农药混合标准溶液，在-18 ℃条件下保存。

1.3 仪器与设备

液相色谱串联质谱仪（配电喷雾离子源（ESI），Triple Quad 5500+，美国AB SCIEX公司）；离心机（Thermo Sorvall RC-6 Plus，美Thermo Fisher公司）；超声清洗仪（KQ-800KDB型，昆山市超声仪器有限公司）；多位涡旋仪（Multi Reax，德国Heidolph公司）。

1.4 前处理方法

称取2 g（精确至0.001 g）匀浆虾肉试样于50 mL离心管中，加入10 mL 80%乙腈水溶液，涡旋混匀，振荡提取5 min，超声提取10 min。加入1.0 g氯化钠，涡旋混合2 min，按4 000 r/min离心5 min，乙腈层经SCRS萃取柱净化后，取4 mL乙腈净化液置于10 mL离心管并加入50 μL DMSO，于40 ℃氮气吹扫，10%乙腈水溶液定容至1 mL，混匀过0.22 μm滤膜，待上机分析。

1.5 液相色谱条件

Kinetex F5液相色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm，phenonenex公司）；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL；流动相A为水（含0.01%甲酸和2 mmol/L甲酸铵），流动相B为甲醇（含0.01%甲酸和2 mmol/L甲酸铵）。洗脱方式为梯度洗脱，洗脱条件：0.0～1.0 min，97% A；1.0～1.5 min，97% A降至85% A；1.5～2.5 min，85% A降至50% A；2.5～10.0 min，50% A下降到30% A；10.0～13.0 min，30% A下降到2% A；13.0～17.0 min，保持2% A；17.0～17.1 min，2% A上升至97% A；17.1～20.0 min，保持97% A。

1.6 质谱条件

离子源：电喷雾正电离模式（ESI+）。检测方式：多反应监测（MRM）。气帘气（CUR）30 psi；雾化气（GS1）45 psi；辅助气（GS2）45 psi；碰撞气（CAD）9；源温500 ℃；喷雾电压（IS）5 500 V；入口电压（EP）10 V。目标化合物监测离子对和碰撞能量（CE）、去簇电压（DP）参数见表1。

表1 化合物的选择离子及质谱参数

接表1

2 结果与讨论

2.1 仪器条件优化

根据84种农药的理化性质及其相应的母离子，通过仪器软件优化母、子离子信息，选择信号强度大、稳定性高的离子碎片作为定量离子和定性离子，并以此为基础，对离子源参数和去簇电压、碰撞能量等参数进行优化，以多反应监测为检测方式，使目标化合物的离子化达到最佳的水平。

液相色谱方法对目标化合物[15]的定性定量分析有很大的影响，体现在保留时间、基质效应、色谱峰型等方面[16]。在流动相的选择上，有机相分别考察甲醇和乙腈，水相比较纯水、甲酸水、甲酸铵水溶液、乙酸铵水溶液等对梯度洗脱和目标化合物色谱行为的影响。因质谱端扫描应用的是ESI+模式，在流动相中加入低浓度的甲酸，以提供H+，有利于在正扫描模式下目标化合物形成[M+H]+形式的母离子，增强离子化效果；流动相中加入甲酸铵，有利于各物质间的色谱分离和改善色谱峰型。通过试验对比，最终选取水和甲醇作为洗脱溶剂，两者均加入0.01%甲酸和2 mmol/L甲酸铵，以保持在一定流速下甲酸和甲酸铵的比例稳定不变。84种农药的MRM扫描色谱图见图1。

图1 84种农药的MRM扫描色谱图

2.2 前处理条件优化

2.2.1 提取试剂

基于涉及的农药种类较多，其极性、溶解性等理化性质不尽相同，且虾肉的基质成分比较复杂，考察乙腈、乙酸乙酯等常用的针对动物源性基质的药物残留提取试剂[17]对目标化合物的提取效果，并对回收率进行分析，结果见图2。使用80%乙腈作为提取试剂时，回收率在80%～120%的农药数量为65种，占总农药数量的77.4%；分别应用甲醇和乙酸乙酯作为提取试剂，农药最终回收率小于80%的占比分别为91.7%和53.6%。比较常见的提取试剂中添加甲酸、乙酸，使提取条件呈酸性[18]，在80%乙腈中分别添加1%和5%的甲酸，有20种和19种农药落入回收率低于60%的区域。综上，选用80%乙腈作为提取试剂，在处理过程中收取良好的蛋白沉淀效果，并得到目标化合物回收率的保证。

图2 提取试剂对回收率的影响

2.2.2 氮吹条件

氮气吹扫是药物残留定性定量分析中常用的浓缩方式[19]。氮气吹扫的过程可能会影响最终的定量准确性。试验考察净化提取液直接氮气吹扫至干、净化提取液中加入DMSO吹扫、净化提取液中加入DMSO吹扫至干3种情况，结果见图3。在3种条件下，药物回收率没有明显的区别，考虑到氮吹后复溶定容等操作便捷性，选取在净化液中加入DMSO进行氮气吹扫。

图3 氮吹条件对回收率的影响

2.2.3 复溶液成分

样品提取液经浓缩后，复溶步骤采用的试剂种类不一[20-21]，不同的试剂对仪器响应值和回收率有着影响[13]。试验选择10%乙腈、30%乙腈和10%乙腈（含1%甲酸）3种复溶液对氮吹残留物进行处理，经仪器分析，选择30%乙腈作为试验复溶试剂，结果见图4。

图4 复溶液对回收率的影响

2.3 基质效应的考察

虾肉中富含蛋白质、脂肪、矿物质等物质致使样品成分复杂。选用电喷雾离子源，因其特殊的结构特点和电离机理，如果在样品前处理过程中净化效果不佳，会产生影响目标化合物响应强度和定量分析的基质抑制效应[22-23]。在净化过程中，使用SCRS固相萃取柱对提取液中的杂质进行吸附，经SCRS滤过的提取液，通过超高效液相色谱串联质谱分析，得到84种农药残留的基质效应数据，对农药基质效应的强弱进行区域划分[24]，见图5。基质效应落入[80%，100%]区间的农药数量为50种，落入[100%，120%]区间的农药数量为31种，96.4%的农药经试验的前处理后经质谱分析，表现为弱基质抑制效应，表明前处理方法去除杂质能力较强，净化效果良好。虽然基质效应的影响不大，为寻求更精准的定量分析结果，仍选用空白基质加标的方法对目标化合物进行定性定量分析。

图5 84种农药基质效应区间分布

2.4 定量限、回收率和精密度

以南美白对虾空白基质提取溶液配制基质标准曲线对样品进行定量分析，并采用低浓度加标于空白基质样品，计算信噪比得到方法定量限（limits of quantification，rSN=10）[25]，84种农药的定量限为1～10 μg/kg。针对于方法准确性和稳健性，考察方法的回收率和精密度。选取空白南美白对虾样品进行标准添加，低、中、高3个添加水平（设置含量水平为5，10和50 μg/kg），每个水平做6个平行样，进行前处理和上机仪器分析。经计算得出各种药物在低、中、高3个添加水平的回收率分别为62.4%～127.1%，58.0%～121.6%和51.9%～132.2%，精密度分别为0.13%～ 11.04%，0.69%～8.42%和0.29%～8.11%。

2.5 实际样品测定

抽取35批市售南美白对虾样品，依照建立的试验方法，对84种农药残留进行测定分析。分析结果显示，抽取的南美白对虾样品中，有4批样品检出西草净，含量范围为8.16～14.61 μg/kg，未检测到其他农药残留。

3 结论

试验建立快速测定南美白对虾中的84种农药残留的固相萃取-液相色谱串联质谱分析方法。试样用80%乙腈提取，通过盐析使乙腈与水相分层，利用SCRS快速固相萃取吸附杂质进行净化，超高效液相色谱串联质谱分析检测，基质标定量。试验方法简单快捷，准确稳健，能够对南美白对虾样品中84种农药残留进行定性定量分析，为检测南美白对虾以至其他水产品中农药残留提供方便、可靠的实验室方法。