干酪中生物活性化合物的产生及生理功能的研究进展

司阔林，闫清泉，吴政，李玲玉，赵中华，宗学醒

内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司（呼和浩特 011500）

干酪（cheese）种类众多、用途广泛且高营养健康，通常是由牛乳经凝乳酶凝乳排乳清制得新鲜或发酵成熟的乳制品。干酪在成熟过程中会涉及一系列复杂的生物化学反应从而产生或释放多种生物活性成分——肽、胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）、脂肪酸、有机酸、维生素、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和共轭亚油酸（CLA）。体内和体外研究表明，这些化合物具有多种重要的健康益处，包括抗氧化、抗增殖、抗炎、免疫调节和抗菌活性等生理功能[1]。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）通过代谢牛乳蛋白质增强干酪功能及最终产品的质地和风味的形成外，在生物活性化合物的产生过程中也发挥主要作用[2]。因此，详细概述影响干酪生物活性成分产生的影响因素，并对不同类型干酪中的生物活性成分及生理功能进行介绍。

1 干酪生物活性成分产生的影响因素

1.1 干酪加工技术对生物活性成分产生的影响

干酪的制作是一个复杂的动态变化过程，一些工艺程序如热处理方式、均质、加压和牛乳凝固方式等都可能会影响牛乳成分的结构，从而影响生物活性化合物的产生和释放[3-4]。

研究表明，热处理会改变牛乳及干酪成分（如蛋白质含量），从而影响干酪的质量[5-6]，然而Hilario等[7]研究表明，热处理不会影响干酪的蛋白质含量和脂肪酸分布。Albenzio等[5]分别用生牛乳和巴氏杀菌牛乳（在80 ℃热乳清中热处理凝乳30 s）制成干酪，结果表明，热处理牛乳制成的干酪的水溶性氮含量和总氮含量比生牛乳制成的干酪要高。Lee等[8]对牛乳分别进行不同的加热方式（65 ℃，30 min、65 ℃，15 s和72 ℃，15 s）后制作成Cheddar干酪，结果表明，72 ℃，15 s热处理的牛乳制作的干酪中微生物多样性最低，而65 ℃，15 s热处理的牛乳制作的干酪具有最高的蛋白水解和脂解活性，由此基本上能够得出热处理条件会影响生物活性肽的数量和特定序列。

干酪蛋白质的变化通常与它们的功能特性有关，并受牛乳特有酶作用的影响。牛乳中的蛋白酶和肽酶（主要为纤溶酶）水解蛋白质生成大肽和中肽，这些肽再在凝乳酶的作用下进一步水解，在发酵剂和非附属发酵剂的作用下形成短肽或游离氨基酸（图1）[6]。牛乳中的纤溶酶耐热性较强，在加热过程中天然纤溶酶抑制剂的失活及牛乳中的纤溶酶原被激活导致其活性增加，因此，干酪生产过程中对牛乳巴氏杀菌或热处理有利于肽的形成[9]。Moatsou等[10]研究也发现，在干酪制作过程中，纤溶酶活性也与温度和压力等加工条件有直接相关性。相比于纤溶酶，牛乳中的另外一种蛋白质水解酶组织蛋白酶D在巴氏杀菌和乳清排出后活性受到明显抑制[6]。

图1 干酪成熟过程中蛋白质分解和氨基酸分解代谢概述

此外，Paul等[11]通过氧自由基吸收能力（ORAC）方法评估发现，在新鲜干酪包装过程中高压和高温会影响含有生物活性肽的水溶性蛋白质的抗氧化活性。另一项研究表明，对Garrotxa干酪施加高静水压力（400 MPa，5 min，14 ℃）会影响脂肪分解且游离脂肪酸含量较低，这可能是由于微生物的减少或次级微生物群的脂解酶失活[12]。

1.2 成熟条件和乳酸菌对生物活性成分产生的影响

干酪成熟时期产生的生物活性短肽的含量会受到多种因素的影响，其中成熟时间和温度可影响干酪中菌株的活性及酶的活力，从而影响干酪蛋白质的水解和生物活性肽的产生。马玲等[13]测量不同成熟时期Mozzarella干酪的不同抗氧化指标，结果表明成熟40 d的Mozzarella干酪的DPPH自由基清除率最高达到67.76%，成熟50 d的Mozzarella干酪的还原力最强，达到1.23，同时通过小鼠试验验证提取液具有一定抗氧化性。Ong等[14]发现4 ℃和8 ℃的成熟条件对Cheddar干酪的血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽不存在显著的影响（P＜0.05），但ACE抑制肽一般都是在成熟初期积累，随着成熟时间的延长及蛋白质水解的进行，部分肽会被水解成小肽。Rizzello等[15]通过对不同成熟期的各类干酪生物活性进行对比发现，未经成熟的新鲜模拟干酪的水溶性提取物（WSE）具有较强的抑菌活性，而成熟期较长的两种意大利干酪的提取物则不具有抑制致病菌生长的功能。

干酪内微生物是一个动态、多菌相的系统，特点是乳酸菌、酵母和霉菌共存，但都会存在着优势菌群，在干酪感官特性的形成和干酪生产的技术方面发挥重要作用。在制作干酪过程中，乳酸菌一方面作为发酵剂（starer lactic acid bacteria，SLAB）添加，其蛋白水解系统能够在干酪成熟过程中有序协调地参与酪蛋白的降解作用，另一方面为牛乳中自然存在的非发酵剂乳酸菌（non-starer lactic acid bacteria，NSLAB，主要为乳杆菌），非发酵剂乳酸菌在干酪成熟的前几周低速生长，最终在发酵剂乳酸菌死亡阶段后成为干酪内的优势菌群。这2组不同来源的乳酸菌在干酪成熟过程中代谢释放出生物活性肽、EPS、维生素、CLA、GABA和低聚糖等生物活性成分（图2）[16]。

图2 乳酸菌在干酪成熟过程中所释放的生物活性成分及过程

2 不同干酪中生物活性成分及其生理功能

2.1 生物活性肽

生物活性肽是指对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的特定蛋白质片段，又称功能肽，在细胞生理及代谢功能的调节上具有重要作用，如神经系统、消化系统、循环系统、内分泌系统等。生物活性肽的功能取决于肽的蛋白质和氨基酸序列的特定水解，这导致不同生物活性特性的表达（表1）。

表1 不同类型干酪在发酵和成熟过程中产生的生物活性肽

干酪中的主要生物活性肽包括三肽异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸（IPP）和缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸（VPP），具有ACE抑制活性，ACE抑制肽在人体中激肽释放酶-激肽系统和肾素-血管紧张素系统，在血压调节方面是一对相互拮抗的体系，其平衡协调对维持正常血压有重要作用[24]。Bütikofer等[25]通过质谱联用方法对44种传统软干酪、半硬质干酪和硬质干酪中的IPP和VPP进行定量分析发现，IPP和VPP的最大浓度分别为95和224 mg/kg，并测定其ACE活性，IC50值介于2.0～29.5 mg/mL。有研究证明[26]，长成熟期的Cheddar干酪为ACE抑制肽的重要来源，除VPP和IPP外，还包括EKDERF、VRYL、YPFPGPIPN、FFVAP，且随着成熟时间的延长，威斯康星州Cheddar干酪中的ACE抑制肽类型和浓度增加，IPP、VPP和EKDERF的最大值分别为2.8，7.4和5.3 mg/100 g；然而，与成熟时间较短的（3-6 d）干酪相比，Cheddar干酪的水溶性提取物部分的ACE活性随着成熟时间的增加而下降（长达2个月），随后ACE活性稳定或增加，这表明成熟过程对干酪生物活性肽抗高血压的重要性。值得注意的是，干酪经胃肠道消化后其肽谱会发生变化，从而可能导致这些肽的生物活性程度也发生变化，如Gamalost干酪和Norvegia干酪的ACE活性在胃肠道消化过程中会有所提高[27]。

抗氧化肽能够清除自由基从而防止脂质过氧化的发生，与合成抗氧化剂相比，抗氧化肽无副作用，易消化吸收，营养和加工特性良好。随着乳制品加工技术的发展和研究的深入，国内外学者逐渐认识到乳蛋白的水解产物具有优良的抗氧化性。Higurashi等[28]从Gouda干酪中分离得到抗氧化肽，结构为HPIL和HGGLPG，这2种肽段的分子量均小于3 kDa，且具有较高DPPH自由基清除能力，是市售化学抗氧化剂的2倍。Timon等[29]使用不同来源的凝乳酶生产的硬质干酪富含抗氧化肽、EIVPN、DKIHPF和VAPFPQ，具有高金属螯合活性。相关研究表明，抗氧化肽的抗氧化活性与其氨基酸组成有关系，当肽中含有疏水性和酸性氨基酸，极易与疏水性多不饱和脂肪酸结合，抑制脂质氧化，从而增加抗氧化肽的抗氧化活性。

除ACE抑制肽和抗氧化肽外，干酪中还有免疫调节肽、抗菌肽、阿片活性肽、抗肿瘤肽等生物活性肽。研究学者从酪蛋白的水解产物中分离出抗菌肽，同酪蛋白结构进行比对，发现主要源自αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白，同时这些肽对多种革兰阴性、阳性细菌都具有抑制作用，可以调节肠道内的微生物菌群[22]。Pritchard等[30]对3种不同的澳大利亚Cheddar干酪的水溶性提取物的抑菌性进行了研究，结果发现分子量大于10 kDa的肽可明显地抑制大肠杆菌和蜡状芽孢杆菌的生长。Yasuda等[31]研究12种市售长成熟期干酪对白血病细胞株HL-60生长与其DNA片段诱导的影响，发现多种干酪可以明显抑制癌细胞增长，诱导细胞DNA断裂，并从相应的干酪中分离得到抗肿瘤肽。

2.2 微生物EPS

EPS是由发酵剂和附属发酵剂在食品发酵过程中产生的具有生物活性的碳水化合物大分子，发酵乳制品（如酸奶、干酪和酪乳）主要在乳酸菌的作用下中产生EPS。EPS聚合物以长链形式存在，该长链由支链取代的糖衍生物、重复的糖单元或取代的糖组成，包括磷酸或乙酰基取代基。EPS具有降胆固醇、降血糖和抗氧化等多种重要的益生功能。越来越多的研究将能够代谢EPS的乳酸菌应用到干酪制作中，Nepomuceno等[32]将Lactococcus lactisssp. cremoris，Lactococcus lactisssp. lactis和Streptococcus thermophilus作为发酵剂添加到Prato干酪中，结果发现干酪在成熟期间会代谢产生EPS且其感官特征和生理特性不受影响。同时有研究表明，干酪中的EPS含量除受菌种种类影响外，还与水分和脂肪转化有关，且干酪中含有EPS不仅能够改善生理健康，还可以提高干酪产量，如使用Streptococcus thermophilusST446、Lactobacillus rhamnosusLRA和Lactobacillus plantarumLP作为附属发酵剂生产低脂Caciotta干酪，其保湿性、产量和游离氨基酸含量都显著提高[33]。然而富含EPS的干酪还需要通过动物研究和临床试验进一步研究和验证其特定的健康益处。

2.3 γ-氨基丁酸（GABA）

GABA是一种非蛋白质氨基酸，是植物和微生物通过谷氨酸脱羧产生的代谢产物，作为哺乳动物大脑中的主要抑制性神经递质，具有降血压、抗癫痫、抗抑郁等多种重要的生理功能。据报道，乳杆菌属和乳球菌属的细菌从发酵食品中产GABA，其中从干酪中已分离出产GABA的Lactobacillus delbrueckiissp. bulgaricus、Lactobacillus plantarum和Lactobacillus paracasei[34]。Diana等[35]采用高效液相色谱法测定34种西班牙手工干酪中的GABA含量，结果表明，GABA浓度高达330 mg/kg且不受成熟期或奶源的影响。由于谷氨酸通过酪蛋白水解、低pH环境及厌氧作用合成GABA，因此适当的成熟条件可以促进干酪中GABA含量增加，尤其是乳酸菌发酵剂种类的选择，Lacroix等[36]研究发现，乳酸菌发酵剂ULAAC-A和ULAAC-H在加拿大干酪中能产生大量GABA，且对来自9种法国的商用干酪进行检测，结果发现其中4种干酪中检测到GABA，且成熟期较长的Danish Havarti干酪GABA含量最高为324 mg/100 g，这表明长时间的成熟过程导致更高浓度的游离氨基酸和谷氨酸；而Gouda干酪GABA含量仅129 mg/100 g，但是其谷氨酸含量最低，这表明其已基本转化为GABA。

2.4 共轭亚油酸（CLA）

干酪中的脂肪含量为20%～35%，而在脂肪含量中，约66%为饱和脂肪酸（SFA），30%为单不饱和脂肪酸（MUFA），4%为多不饱和脂肪酸（PUFA）。脂肪酸参与各种生物过程，充当能量底物和调节细胞，并影响基因表达、PUFA生物利用度和脂肪沉积。在自然界中的共轭脂肪酸中，CLA异构体被认为是功能性脂质分子，是具有共轭双键的亚油酸（C18∶2）的一组异构体，主要异构体为c9、t11-CLA、t10和c12-CLA，其中c9，t11-CLA具极强免疫调节活性，如抗氧化、抗高血压、抗癌、抗脂肪、抗炎、抗糖尿病和抗肥胖等生理特性[1]。CLA异构体天然存在于牛乳中，干酪中CLA含量占总脂肪酸的0.05%～2.86%，乳酸菌主要利用水合酶、脱氢酶、异构酶和还原酶对脂肪酸生物氢化，从而合成CLA，因此干酪中CLA的合成及含量取决于发酵时间、原料乳中CLA的组成以及乳酸菌的亚油酸异构酶活性。有大量研究生产出具有高含量CLA的干酪：Ares-Yebra等[37]从生牛乳中分离出的产CLA的Lactobacillus plantarumL200被用于生产微型干酪，制备的干酪中含有高含量的c9和t11-CLA；Gursoy等[38]使用Lactobacillus acidophilus，Lactobacillus paracasei和Bifidobacterium longum后，干酪中CLA的含量分别增加16.25%，7.64%和20.44%，因此从未开发的干酪产品中寻找具有适当组合的潜在菌株，很大程度能找到生产富含CLA干酪产品的有效菌株。此外，植烷酸（C20）也是干酪中另一种重要的脂肪酸，被4个甲基分链饱和，具有增强肝细胞摄取葡萄糖的能力，能够改善葡萄糖稳态，并防止MetS和2型糖尿病发生。

2.5 有机酸

干酪中乳酸菌的自溶使参与干酪成熟的细胞内酶更容易到达其底物，释放出抗菌物质，如有机酸、二乙酰、乙偶姻、过氧化氢和细菌素等，其中Cheddar干酪中的苹果酸及Ossalano干酪中的柠檬酸、乳清酸、丙酮酸、乳酸、尿酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和马尿酸等有机酸均已被检测到[39]。这些有机酸有助于干酪风味的形成及品质的提升，如Swiss干酪中的丙酸杆菌代谢乳酸生产丙酸，是其风味形成的关键。根据微生物的生理状态和外部环境的物理化学特征，有机酸可作为具有抑菌和杀菌活性的抗菌剂，从而提高干酪的卫生质量，因此定量测定干酪中的有机酸对于监测细菌生长和感官质量非常重要。

2.6 维生素和矿物质

牛乳中的大部分脂溶性维生素都保留在干酪中，然而由于乳清的排出，干酪中水溶性维生素的浓度通常低于牛乳中的浓度。干酪中的维生素主要有核黄素、维生素B12、烟酸、叶酸和维生素A，具有多种生物学功能，如刺激免疫系统、调节基因表达和维持弱视视力等。值得注意的是，干酪成熟过程中微生物合成维生素能够很大程度地抵消B族维生素的损失，如Emmental干酪中的丙酸菌能够合成大量维生素B12，且50 g Cheddar干酪可分别为男性和女性提供28%和32%的建议每日维生素A摄入量[40]。

干酪也是几种矿物质的重要来源，尤其是钙、锌、磷和镁。干酪中的钙和磷含量远高于牛乳：软干酪中的钙和磷含量是牛乳的4～5倍，半硬质干酪中的钙和磷含量是牛乳的7到8倍，硬质干酪中的钙和磷含量达10倍，且50 g硬质干酪可提供约400 mg钙，涵盖1～10岁儿童每日推荐钙摄入量的100%。此外，钙磷比有着特殊的生理功能，它以一种高度生物可利用的形式被消化，由于钙和干酪中的酪蛋白肽之间形成复合物，保持钙的可溶形式，并保护钙不在肠内沉淀从而促进钙的吸收。干酪是生物可利用钙的优秀来源，且膳食钙和维生素D在与低热量饮食相结合时，有可能预防骨质疏松症并有助于减肥，此外膳食已证明，钙通过抑制脂肪和胆汁酸的吸收、增加粪便脂肪的排泄以及诱导胆固醇转化为胆汁，具有降血脂机制。

3 结语

干酪种类众多且风味独特，是世界上最受欢迎的发酵乳制品之一。尽管近年来干酪因脂肪和钠含量而有一些负面影响，但其仍然具有多种生物活性成分且已被证明对机体有着非常重要的生理功能特性，如已报道，摄入干酪具有降血压和降低心血管危险因素（肥胖、血脂异常和2型糖尿病）的潜力，干酪中的成分是释放生物活性化合物的良好前体，乳酸菌在成熟过程中有着主导作用。干酪中的生物活性化合物主要为乳酸菌水解蛋白质而成的生物活性肽。GABA和CLA也是重要的代谢产物，具有预防疾病的巨大潜力。此外其他重要的化合物，如EPS可以增强干酪的流变特性，具有抗氧化、抗菌和免疫特性。评估食品成分的生物活性时，需考虑多方面，因此仍需更多的体外和体内研究来证明食用新鲜和成熟干酪所带来的健康益处和生物活性效应。